БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 3, с. 188 - 196
УДК 577.113.4:543.422.25
РАСЩЕПЛЕНИЕ ДВУХЦЕПОЧЕЧНОЙ ДНК-МИШЕНИ БЛЕОМИЦИНОВЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ, ОБРАЗУЮЩИМИ ТРОЙНОЙ КОМПЛЕКС
© 1995 г. Д. С. Сергеев, Т. С. Годовикова, В. Ф. Зарытова*
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 8
Поступила в редакцию 15.02.94 г.
Показано, что производные гексадекатимидилата, содержащие ковалентно присоединенный остаток противоопухолевого антибиотика блеомицина А3, способны образовывать тройной комплекс с двухцепочечной 30-звенной ДНК-мишенью и в составе этого комплекса осуществлять комплементарно-адресованную модификацию. Вместе с этим в условиях 5-кратного избытка реагента по отношению к мишени наблюдается неспецифическое расщепление в основном пиримидинбогатой цепи Д1Ж-мишени. Сопоставление общих степеней расщепления цепей мишени 5'- и З'-блеомици-новыми производными гексадекатимидилата (25 и 35% для пуринбогатой и 47 и 36% для пиримидин-богатой цепи) с неспецифическим расщеплением (6% для пуринбогатой и 16% для пиримидинбогатой цепи), вызванным 5'-блеомициновым производным гексадекануклеотнда, не образующим тройной комплекс, свидетельствует о преобладании сайт-специфического расщепления над неспецифическим, Плавление триплекса, образованного 5'-блеомициновым производным гексадекатимидилата с ДНК-мишеныо, происходит при температуре на 5°С ниже (т. пл. 40°С), чем плавление аналогичного триплекса, образованного гексадекатимидилатом. При понижении температуры с 50 до 20°С степень расщепления ДПК-мишени возрастает в соответствии с долей молекул мишени, находящихся в тройном комплексе.
Ключевые слова: тройной комплекс, блеомицин, олигону клеотиды, сашп-специфическаг деструкция ДНК.
Использование реакционноспособных производных олигонуклеотидов, способных воздействовать на выбранные участки двухцепочечной ДНК посредством формирования тройного комплекса, является одним из перспективных направлений в рамках исследований по созданию ген-направленных соединений [1]. В качестве таких производных ранее были использованы олигонук-леотиды, содержащие алкилирующие [2, 3], фотоактивные группировки [4 - 6], группировки окислительно-восстановительного механизма действия [7, 8]. В качестве последних были использованы хорошо известные ДНК-расщепляющие агенты: комплексы ЕБТА с железом и 1,10-фенантролина с медью, В ряду группировок окислительно-восстановительного механизма действия заслуживает внимания противоопухолевый антибиотик блеомицин [9, 10], с высокой эффективностью вызывающий одно- и двухцепочечные разрывы ДНК [11-13], что считается основой его биологи-
Используемые сокращения: ЕБТА - М^^'^'-этиленди-аминтетрауксусная кислота, В1т-Б1Н - блеомицин А5. Префикс "с!" в аббревиатуре олигонуклеотидов и их производных опущен.
* Автор для переписки.
ческой активности. Как показано нами ранее, высокая эффективность в деградации ДНК свойственна также блеомициновым производным олигонуклеотидов в составе двойного комплекса 114 - \6]. Эти свойства антибиотика делают привлекательным использование блеомицина в качестве расщепляющей группировки в составе оли-гонуклеотида, образующего тройной комплекс с целевой двухцепочечной ДНК,
Целью данной работы является исследование деструкции двухцепочечной ДНК блеомицино-выми производными олигонуклеотидов, образующими с ней тройной комплекс.
Выбор ДНК-мишени для воздействия олиго-нуклеотидного реагента в составе тройного комплекса осуществляли в соответствии со следующими требованиями. Во-первых, она должна содержать участок гомопуриновой и гомопири-мидиновой последовательностей для формирования тройного комплекса. Во-вторых, прочный тройной комплекс должен образовываться при нейтральных рН, поскольку блеомицин эффективно расщепляет ДНК в пределах рН 7 - 9 [17]. При таких рН образуются прочные тройные комплексы состава Т • А ■ Т [18, 19]. В-третьих,
I > ( >
4 8 10
5' рО-С-С-С-А—С—в-А—А-А-А-А-А-А—А—А-А-А-А—А—А-А—А-О-Т—С—О—А-С-й 3'
5' (В1ш-К) рТ-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т 3'
3' С-О-С-С-Т-О-С-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-С-А-О-С-Т-С-С« 5' 30 28 26 23 13
Триплекс I
I I I
21 23 25 28
5' рС-С-С;-С-А-С-С-А-А-А -А-А-А-А"А-А-А-А-А-А-А-А-А-С;-Т~С-0-А-С-0 3'
5' Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Тр (Я-В1т) 3'
3' С-С-С-О-Т-О-С-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-Т-С-А-С-С-Т-С-С,, 5' 30 28 26 11 9 7 6 ^
Триплекс II
Рис, 1. Триплексы I и II ДНК-мишени с 5'- и З'-олеомициновыми производными гексадекатимидилата. Стрелками указаны места расщепления. Длина стрелок соответствует интенсивности расщепления.
участок образования комплекса с реагентом должен быть фланкирован последовательностями, которые будут являться мишенью для воздействия остатка блеомицина при формировании тройного комплекса. Блеомицин вызывает расщепление ДНК преимущественно в последовательностях ОТ, вС, АТ и ОА по дезоксирибозе второго нуклеотида [20, 21]. Исходя из этого была выбрана 30-звенная двухцепочечная мишень, представленная на рис. 1.
Воздействие на данную мишень 16-звенного олиготимидилатного реагента, несущего кова-лентно связанный с 5'-концевым фосфатом остаток блеомицина, в условиях образования тройного комплекса приводит к расщеплению мишени {рис. 1, 2, триплекс I). Пуринбогатая цепь расщепляется в районе 5'-конца о^о(А)-тракта (дорожка 2), а пиримидинбогатая цепь - в районе З'-конца оП§о(Т)-тракта (дорожка 6), т.е. вблизи расположения остатка антибиотика при связывании третьей цепи (реагента) параллельно пуринбогатой и антипараллельно пиримидинбогатой последовательностям. Это согласуется с литературными данными [7, 8] по расщеплению ДНК Е1УГА- и 1,10-фенантролинсодержащими олигонуклеотид-ными реагентами, образующими с пей тройной комплекс. Отсутствие расщепления А-богатой
цепи на З'-конце свидетельствует о том, что в выбранных условиях не происходит формирования уотсон-криковского комплекса между реагентом и данной цепью.
Воздействие З'-блеомицинового производного гексадекатимидилата на двухцепочечную ДНК-мишень в условиях образованиях тройного комплекса (рис. 1, 2, триплекс II) приводит к расщеплению пуринбогатой цепи в районе З'-конца о^о(А)-тракта и пнримидинбогатой цени в районе 5'-конца о^о(Т)-тракта (дорожки 3 и / соответственно). Кроме данного сайт-специфического расщепления, которое осуществляется благодаря образованию тройного комплекса, наблюдается заметное расщепление на З'-конце пиримидинбогатой цепи (дорожка 7). Это неспецифическое расщепление происходит по С30, С28 и Т2(" в последовательностях СС и СТ, предпочтительных для связывания и расщепления самим блеомицином [20-22].
Известно, что блеомицин способен связываться с ДНК [23], и в условиях 5-кратного избытка реагента по отношению к мишени данное расщепление может быть обусловлено взаимодействием остатка блеомицина с двухцепочечной ДНК без формирования триплекса ол и гону кл е отид ной частью реагента. Для проверки данного предположения
Т +
С
ВР
А С
с
л
с
им *
т -
с-
А
О
с-
Рис. 2. Радиоавтограф олектрофоретического анализа расщепления двухцепочечной ДНК-мишени (1 мкМ) в триплекса* 1 и II блеомицинсодержащими олигонуклеотидными реагентами (5 мкМ) при 20°С. Дорожки 1 -4 - 5'-32Р-мече-ная А-богатая цепь, дорожки 5 -8 - 5'-32Р-меченая Т-богатая цепь. 1 и 5 - двухцепочечная ДНК-мишень без реагента в условиях реакции; 2, б и 3, 7 - расщепление ДНК-мишени соответственно 5'- и З'-блеомициновыми производными гексадекатимидилата; 4 и 8 - расщепление ДНК-мишени 16-звенным блеомицинсодержащим олигонуклеотидом (Шт-Г1)рСАОССООАТОСААСАС, не образующим тройной комплекс. ХС и ВР - красители-маркеры ксиленцианол и бромфеноловый синий.
было проведено расщепление ДНК-мишени 5'-блеомициновым производным 16-звенного оли-гонуклеотида {В1т-К)рСАССООСАТОСААСАС, не образующего тройной комплекс с мишенью. При этом расщепления пуринбогатой цепи практически не происходит (дорожка 4), а пиримидин-богатая цепь, как и в случае блеомициновых производных гексадекатимидилата, расщепляется на З'-конце по С30, С28 и Т26 (дорожка 8). Это свидетельствует о том, что воздействие на двухце-почечную ДНК-мишень 5'- и З'-блеомициновых производных гексадекатимидилата при 5-кратном избытке последних осуществляется как сайт-сттецифически, за счет адресовки олигонуклеоти-дом при образовании тройного комплекса, так и неспецифически, за счет связывания остатка бле-омицина с двухцепочечной ДНК.
Сравнивая общие степени расщепления двухцепочечной ДНК-мишени блеомицинсодержа-щими реагентами (таблица), можно заключить, что как для 5'-, так и для З'-блеомициновых производных гексадекатимидилата сайт-специфическое расщепление, обусловленное образованием тройного комплекса, преобладает над неспецифическим, обусловленным деструкцией ДНК остатком блеомицина без образования тройного комплекса. При этом расщепление в составе ! резного комплекса пиримидинбогатой цепи З'-реаген-том осуществляется по А6-Ти (рис. 1, триплекс II) и 5'-реагентом по С24-Т13 (триплекс I).
Степень расщепления ДНК-мишени блеоми-циновыми производными о л иго н у к л еот и до в можно повысить, увеличив избыток реагента по отношению к мишени. Однако в этом случае можно ожидать, что доля сайт-специфического расщепления уменьшится, поскольку возрастет число молекул реагента, не участвующих в образовании тройного комплекса. Повышение избытка 5'-блеомицинового производного гексадекатимидилата от 1 до 50-кратного по отношению к мишени приводит к увеличению общей степени расщепления с 7 до 63% (рис. 3, дорожки 2 - 5). Такое же повышение избытка 5'-блеомицинового производного олигонуклеогида, не образующего тройной комплекс с мишенью, увеличивает степень расщепления пиримидинбогатой цепи с 2 до 48% (дорожки б - 9). Разница между сайт-специфи-ческим и неспецифическим расщеплением оказывается максимальной (31 - 35%) при 5 - 10-кратном избытке реагента над мишенью.
На рис. 4 представлены результаты экспериментов по термической денатурации 30-звенной двухцепочечной ДНК-мишени и ее комплексов с гексадекатимидилатом и 5'-блеомициновым производным гексадекатимидилата. Сра
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.