ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 9, с. 965-968
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
РАЗДЕЛЕНИЕ ЭКЗО- И ЭНДОГЕННЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ МИЦЕЛЛЯРНОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ
© 2007 г. Л. А. Карпова, Е. Г. Стрельникова
Санкт-Петербургский государственный университет, химический факультет 198904 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 2 Поступила в редакцию 14.03.2006 г., после доработки 25.05.2006 г.
Выбраны условия разделения преднизолона, дексаметазона, кортизола, кортизона и кортизон-ацетата методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии на пластинках ПТСХ-АФ-В-УФ с мицеллярной подвижной фазой - 12 мМ водным раствором додецилсульфата натрия. Гормоны идентифицировали УФ-облучением (254 нм).
Современная высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ), как правило, не уступает другим хроматографическим методам по точности и воспроизводимости. Основными достоинствами метода ВЭТСХ являются: доступность и относительная дешевизна оборудования; универсальность; возможность одновременного анализа нескольких образцов; легкая и быстрая смена растворителей; возможность сохранения хромато-граммы с разделенными образцами с последующим их детектированием [1].
Впервые поверхностно-активные вещества (ПАВ) в планарной хроматографии применили в 1963 г. в бумажной хроматографии [2]. Значительно позднее ПАВ стали использовать для им-прегнирования различных сорбентов в ТСХ [3] -в составе мицеллярных подвижных фаз [4]. Было показано, что ПАВ модифицируют как подвижную (ПФ), так и неподвижную (НФ) фазы, в результате чего последняя приобретает качественно новые свойства [4]. Существуют несколько вариантов метода ТСХ с применением ПАВ [5].
При модификации подвижной фазы водно-ми-целлярными растворами ПАВ их концентрация в элюенте больше, чем критическая концентрация мицеллообразования (ККМ). Мицеллы ПАВ избирательно солюбилизируют гидрофильные и гидрофобные вещества. Этот метод называется мицеллярной ТСХ (МТСХ). Неподвижная фаза подвергается модификации за счет адсорбции гидрофобных ПАВ, находящихся в составе элюента. При модификация подвижной фазы молекулярными растворами ионных ПАВ концентрация ПАВ в растворе меньше ККМ, они выполняют функцию гидрофобных противоионов для разделяемых веществ. В этом случае реализуется ион-парный механизм ТСХ. Модификация неподвижной фазы имеет динамический характер. Прямое
статическое модифицирование только неподвижной фазы осуществляют импрегнированием поверхности пластин водно-метанольными или эта-нольными растворами ПАВ. Элюентами в этом случае являются преимущественно водно-органические растворы.
Используют все типы ПАВ: катионные (бромид и хлорид цетилтриметиламмония), анионные (додецилсульфат натрия) и неионные (Твин-80, Тритон Х-100) [5]. Концентрации ПАВ составляют от 1.5-5 ККМ до 10-50 ККМ.
В МТСХ, в отличие от ТСХ с водно-органическими элюентами, хроматографическое поведение сорбата определяется коэффициентом распределения между мицеллой и водой, коэффициентом распределения между неподвижной фазой и водой и коэффициентом распределения между неподвижной фазой и мицеллой.
В настоящей работе изучено изменение селективности разделения некоторых эндо- и экзогенных кортикостероидов методами ТСХ и ВЭТСХ с подвижными фазами, содержащими мицеллы додецилсульфата натрия.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Стандартные растворы кортизола и кортизона (фирма "Sigma", США) с концентрацией 1 мг/мл готовили растворением навесок по 1 мг каждого из стероидов в 1 мл ацетонитрила во фторопластовых пробирках. Стандартные растворы лекарственных препаратов (преднизолон, кортизон-ацетат) готовили растворением навесок, взятых из таблеток. Концентрация действующего вещества - 1 мг/мл. Дексаметазон использовали в виде суспензии (глазные капли) с концентрацией 1 мг/мл. Полученные растворы до хроматографического анализа хранили в морозильной камере при -
ИОИ2СЧ СИ3
Ю
ИОИ2С.
ИОИ2С
ИО
СИз
■"(Я'Г
(Я) (Я)
(Я/^ОИ
О ¿,«ОИ
(5) (5) ИИ
щ.
И
Кортизол
О
ОИ СИз
Кортизон
ОИ
О
(2)
Преднизолон
Дексаметазон Кортизон-ацетат
Рис. 1. Структурные формулы определяемых стероидных гормонов.
20°С. В качестве подвижной фазы использовали дистиллированную воду с добавкой 3; 5; 8.3; 12; 15; 17; 20 мМ додецилсульфата натрия (ДДСН). Разделение проводили на хроматографических пластинках Silufol ЦУ 254 (Чехия) и ПТСХ-АФ-В-УФ, X 254 нм ("ЛенХром") с применением однократного элюирования. Детектировали с помощью УФ-комплекса "УФС 254/365".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В работе изучено разделение некоторых эндогенных (кортизол, кортизон) и экзогенных (пред-
R
10
15
20 25
СДДСН, м
Рис. 2. Зависимость величины Rf преднизолона от концентрации ДДСН в воде на пластинках 8ПиМ.
низолон, дексаметазон, кортизон-ацетат) корти-костероидов (рис. 1).
Водные подвижные фазы характеризуются низкой стоимостью, нетоксичностью, отсутствием запаха, хорошей биоразлагаемостью. В качестве величины удерживания рассчитывали относительную скорость (подвижность)
где - расстояние, пройденное аналитом от старта до центра пятна (мм); Ъм - расстояние, пройденное элюентом от старта до линии фронта (мм).
Прежде чем приступить к разделению стероидов методом ВЭТСХ изучено удерживание преднизолона в условиях традиционной ТСХ на пластинках Silufol. На рис. 2 представлена зависимость величины . преднизолона от концентрации ДДСН в воде. Зависимость линейна и описывается уравнением у = 0.0156х + 0.2548 с коэффициентом корреляции .К2 = 0.9991.
В отсутствие ДДСН в элюенте преднизолон движется с фронтом подвижной фазы, образуя сильно размытое пятно от стартовой линии. При дальнейшем увеличении концентрации ДДСН в подвижной фазе пятно становится более компактным. Оптимальная подвижная фаза для разделения гормонов на пластинках Silufol содержит 15 мМ ДДСН.
При разделении ВЭТСХ установлено, что, если в качестве подвижной фазы использовали чистую воду, дексаметазон и кортизон-ацетат остаются на старте, а кортизон незначительно смеща-
5
0
РАЗДЕЛЕНИЕ ЭКЗО- И ЭНДОГЕННЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ
967
ется с линии старта, образуя сильно размытую хроматографическую зону (рис. 3).
На хроматографической пластине после проведения анализа отмечается двойной слой подвижной фазы: первый - водный, второй (чуть ниже) - раствора мономеров ДДСН. Rf кортизон-ацетата начинает возрастать при добавлении 12 мМ ДДСН. Данная концентрация ПАВ является оптимальной для разделения изученных стероидных гормонов, так как все аналиты регистрируются в области между стартовой линией и линией фронта растворителя (рис. 4). В этом случае концентрация ДДСН в подвижной фазе больше, чем ККМ, и мицеллы ПАВ избирательно взаимодействуют с гидрофильными и гидрофобными ана-литами.
При дальнейшем увеличении концентрации ДДСН (до 17 - 20 мМ) наблюдается движение преднизолона, дексаметазона и кортизола с водным фронтом. В случае же, когда концентрация ПАВ достигает 20 мМ, преднизолон, дексамета-зон и кортизол переходят в зону между фронтом подвижной фазы и фронтом мономеров ДДСН, а кортизон и кортизон-ацетат распределяются в области между фронтами мономеров и мицелл ПАВ (рис. 4). Все эти три зоны детектируются визуально при УФ-облучении (к 254 нм).
Для преднизолона, кортизола и кортизона зависимость Rf от содержания додецилсульфата натрия является линейной:
Гормон Уравнение прямой R2
Преднизолон у = 0.0208х + 0.5422 0.9930
Кортизол у = 0.0214х + 0.4912 0.9852
Кортизон у = 0.0156х + 0.4159 0.9954
Для дексаметазона и кортизон-ацетата линейная зависимость наблюдается лишь в области концентраций ДДСН 8.3-20 мМ.
Для пар преднизолон-кортизол и кортизол-кортизон разрешение увеличивается при добавлении в элюент ДДСН до концентраций 12 мМ. При дальнейшем увеличении концентрации ПАВ в подвижной фазе для первой пары стероидов наблюдается ухудшение разрешения (оба вещества движутся с фронтом подвижной фазы), а для второй - улучшение.
Таким образом, применение мицеллярных подвижных фаз повышает селективность ВЭТСХ. Основой улучшения селективности является различная степень связывания мицеллами компонентов разделяемой смеси.
R
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
сДДСН
Рис. 3. Зависимость величины Rf стероидных гормонов от концентрации ДДСН в воде на пластинках ПТСХ-АФ-В-УФ. 1 - кортизон-ацетат; 2 - кортизон; 3 - кортизол; 4 - дексаметазон; 5 - преднизолон.
, M
Рис. 4. Разделение модельной смеси стероидных гормонов методом ВЭТСХ с использованием 12 мМ (а) и 20 мМ (б) ДДСН. 1 - кортизон-ацетат; 2 - кортизон; 3 - кортизол; 4 - дексаметазон; 5 - преднизолон.
Избирательная солюбилизация компонентов смеси мицеллами обусловлена комплексом взаимодействий (электростатических, гидрофобных, донорно-акцепторных и т.д.). Выбранная хрома-тографическая система может быть использована для идентификации лекарственных препаратов или для оценки их чистоты.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Красиков В.Д. // Журн. аналит. химии. 2003. Т. 58. № 8. С. 792.
2. Farulla E, Iacobelli-Turi C, Lederer M., Salvetti F. // J. Chromatogr. 1963. V. 12. P. 255.
3. Lepri L, Desideri P.G., Heimler D. // J. Chromatogr. 1978. V. 153. P. 77.
4. Armstrong D, Terril R.Q. // Anal. Chem. 1979. V. 51. № 13. P. 2160.
5. Сумина Е.Г., Штыков СН, Тюрина Н.В. // Журн. аналит. химии. 2003. Т. 58. № 8. С. 808.
0
Separation of Exogenous and Endogenous Steroid Hormones by Micellar High-Performance Thin-Layer Chromatography
L. A. Kartsova and E. G. Strel'nikova
Department of Chemistry, St. Petersburg State University, Universitetskii pr. 2, Petrodvorets, St. Petersburg, 198904 Russia
Abstract—The conditions for the separation of prednisolone, dexamethasone, Cortisol, cortisone, and cortisone acetate are selected using high-performance thin-layer chromatography on PTSKh-AF-V-UF plates with a 12 mM aqueous solution of sodium dodecyl sulfate as a micellar mobile phase. The hormones are identified under UV radiation (254 nm).
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.