научная статья по теме РАЗЛИЧАЮЩИЙСЯ ХАРАКТЕР ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СФИНГОМИЕЛИНСИНТАЗЫ 1 (SGMS1) ЧЕЛОВЕКА В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО И ПИЩЕВОДА Биология

Текст научной статьи на тему «РАЗЛИЧАЮЩИЙСЯ ХАРАКТЕР ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СФИНГОМИЕЛИНСИНТАЗЫ 1 (SGMS1) ЧЕЛОВЕКА В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО И ПИЩЕВОДА»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 395-402

ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА

УДК 577.21

РАЗЛИЧАЮЩИЙСЯ ХАРАКТЕР ЭКСПРЕССИИ ГЕНА СФИНГОМИЕЛИНСИНТАЗЫ 1 (SGMS1) ЧЕЛОВЕКА В ОПУХОЛЯХ ЛЕГКОГО И ПИЩЕВОДА

© 2014 г. А. В. Рожкова1*, М. В. Зиновьева2, А. В. Сасс2, И. Б. Зборовская3, С. А. Лимборская1, Л. В. Дергунова1

Институт молекулярной генетики Российской академии наук, Москва, 123182 2Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва, 117997 3Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук, Москва, 115478 Поступила в редакцию 19.07.2013 г.

Принята к печати 01.11.2013 г.

В последние годы большое внимание уделяется изучению особенностей экспрессии генов в раковых клетках. К числу таких генов относится ген сфингомиелинсинтазы 1 (SGMSl). Сфингомиелинсинтаза 1 (SMS1) катализирует синтез сфингомиелина и диацилглицерина из фосфатидилхолина и церамида. Регулируя уровень проапоптотического медиатора церамида и антиапоптотического медиатора диацилглицерина, SMS1 может поддерживать баланс между процессами клеточной гибели и пролиферации. Кроме того, показано, что содержание сфингомиелина и уровень сфингомиелинсинтазной активности в опухолях многих тканей изменяются. Однако до сих пор практически не изучены особенности функционирования гена SGMS1 на уровне транскрипции. В данной работе исследовали экспрессию гена SGMS1 в опухолях легкого и пищевода человека по сравнению с прилежащей здоровой (неизмененной) тканью с использованием метода ПЦР в реальном времени. В ткани рака легкого уровень экспрессии гена SGMS1 снижается. В опухоли и прилежащей ткани пищевода уровни экспрессии гена SGMS1 статистически не отличаются: в семи из 15 образцов уровень повышается, в пяти — снижается. Таким образом, в опухолях разного происхождения характер экспрессии гена SGMSl различен.

Ключевые слова: сфингомиелинсинтаза1 человека, рак легкого человека, рак пищевода человека, экспрессия гена, уровень транскриптов, ПЦР в реальном времени.

EXPRESSION OF SPHINGOMYELIN SYNTHASE 1 (SGMS1) GENE VARIES IN HUMAN LUNG AND OESOPHAGUS CANCER, by A. V. Rozhkova1*, M. V. Zinovyeva2, A. V. Sass2, I. B. Zborovskaya3, S. A. Limborska1, L. V. Dergunova1 (institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow, 123182 Russia, *e-mail: avrojk@yandex.ru; 2 Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117997 Russia; 3Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia). The investigation of molecular mechanisms contributing to cancer progression is the burning problem of current research. Considerable attention has been given to the study of gene expression in cancer cells. Sphingomyelin synthase 1 gene (SGMS1) is one of the genes whose expression can be altered in cancer. SMS1 enzyme, encoded by this gene, catalyzes the synthesis of sphingomyelin and diacylglycerol from phosphatidylcholine and ceramide. SMS1 may maintain the balance between cell death and survival by regulating the formation of the pro-apoptotic mediator ceramide and anti-apoptotic mediator diacylglycerol. In addition, the changes in sphingomyelin level and sphingomyelin synthase activity have been observed in cancers of many tissues. However the peculiarities of SGMS1 gene transcription have been insufficiently explored. In this work the expression of transcripts of SGMS1 has been investigated by the method of Real Time PCR in matched pairs of samples of human lung and oesophagus cancer and adjacent tissues without pathology. A significant decrease in SMS1 transcripts expression has been found in samples of human lung cancer. At the same time, in the samples of human oesophagus cancer and adjacent tissue, expression of SMS1 transcripts varies insignificantly: it is increased in 7 and decreased in 5 of 15 samples. The obtained results indicate that SGMS1 gene is differently expressed in cancers of different genesis.

Keywords: human sphingomyelin synthase 1, human lung cancer, human oesophagus cancer, gene expression, transcription level, Real-Time PCR.

DOI: 10.7868/S0026898414030173

* Эл. почта: avrojk@yandex.ru

В Европе рак легкого, по данным за 2012 г., занимает четвертое место по числу новых случаев заболевания и первое место по смертности, в Российской Федерации — первое место из общего числа заболеваний у мужчин как по частоте, так и по смертности. Рак пищевода в Европе и в РФ стоит на 8-м месте по общему числу онкологических заболеваний. Однако эти два типа рака характеризуются одинаково высоким соотношением уровней смертности и заболеваемости [1]. При исследовании экспрессии различных генов в раковых клетках легкого и пищевода, по сравнению с соответствующими нормальными тканями, показано, что некоторые из них экспрессируются по-разному в нормальных и опухолевых клетках [2—6]. Продукты этих генов могут участвовать в формировании и развитии опухоли, а оценка их экспрессии в раковых клетках может быть (потенциально) использована для подтверждения возникновения опухоли, для прогнозирования течения заболевания, подбора методов лечения и для проверки новых лекарственных средств.

К числу таких генов может относиться ген сфин-гомиелинсинтазы 1 (SGMS1), структурная организация которого исследована нами ранее [7—9]. В клетках эукариот кодируемый этим геном фермент (SMS1) катализирует синтез сфингомиели-на и диацилглицерина из фосфатидилхолина и церамида. Многочисленные исследования свидетельствуют, что компоненты сфингомиелинового цикла являются активными участниками опухолевого процесса. Достоверно установлено, что проап-оптотический медиатор церамид ингибирует пролиферацию и стимулирует апоптоз клеток, тогда как диацилглицерин способствует пролиферации и выживаемости клеток [10—12]. Таким образом, регулируя уровень этих соединений, SMS1 может поддерживать баланс между процессами клеточной гибели и пролиферации. В большинстве работ, связывающих экспрессию гена SGMS1 с развитием опухоли, анализировали уровень сфингомиелина и/или активность фермента SMS [13—17]. В данной работе мы исследовали изменение уровня экспрессии гена SGMS1 в опухолях рака легкого и пищевода по сравнению с прилежащей тканью.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Образцы тканей. Использовали образцы опухолевых и прилежащих к опухоли здоровых (неизмененных) тканей легкого (19 пар обазцов) и тканей пищевода (15 пар), полученных при резекции опухолей. Для выделения РНК ткани быстро замораживали в жидком азоте. Опухолевые образцы содержат не менее 70% раковых клеток. Пациенты (I—III стадия рака) наблюдались в Российском онкологическом центре им. Н.Н. Блохи-на РАМН и до операции не подвергались химиотерапии и радиотерапии. В качестве контроля ис-

пользовали периферические ткани нормального легкого от пяти человек и центрально локализованные ткани от четырех человек, а также ткани из средней трети нормального пищевода, полученные от трех человек, и ткани нижней трети нормального пищевода, полученные от двух человек post mortem. Все индивиды не имели видимых признаков патологии легкого или пищевода соответственно и погибли внезапно или от травм.

Выделение РНК и синтез кДНК. Тотальную РНК выделяли из растертых в жидком азоте образцов тканей, используя гуанидинизотиоциа-нат/фенольную экстракцию с последующим удалением полисахаридов путем переосаждения РНК [18]. РНК дополнительно очищали с использованием набора "RNeasy Mini RNA Kit" ("Qiagen", США) и обрабатывали ДНКазой I ("Promega") в соответствии с рекомендациями производителя. Качество РНК проверяли путем электрофореза в 1%-ном ага-розном геле, содержащем бромистый этидий. Концентрацию РНК определяли спектрофотометриче-ски. Использовали 1 мкг РНК, праймеры SMART (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCrGr-GrG-3') и CDS (5'-AAGCAGTGGTATCAACGCA-GAGTACT(30)N_ 4 N -3') и обратную транскрипта-зу PowerScript ("Clontech", США), как описано ранее [19]. Порцию реакционной смеси оставляли для синтеза второй цепи кДНК (реампли-фикации) с использованием полимеразы Advantage 2 DNA Polymerase ("Clontech") и праймера 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' в следующих условиях амплификации: 95°C, 1.5 мин (предварительный прогрев); 95°C, 20 с, 65°C, 20 с; 72°C, 3 мин [5].

ОТ-ПЦР в реальном времени. Реакционная смесь для ПЦР объемом 25 мкл содержала 10 мкл реамплификата, по 5 пмоль прямого и обратного праймеров, 10 мкл 2.5-кратной по концентрации реакционной смеси ("Синтол", Россия), которая включает буфер для ПЦР Taq-ДНК-полимеразу, дезоксинуклеотидтрифосфаты и интеркалирую-щий краситель SYBR Green I. Праймеры, специфичные к изучаемым транскриптам гена SGMS1, подобраны при помощи пакета программ OLIGO Primer Analysis Software 6.31 и синтезированы фирмой "Синтол". Для определения уровня экспрессии использовали следующие пары праймеров: для транскриптов гена SGMS1 - F7 (5'-GGCGTAGA-CATCCCCACC-3') и R8 (5'-TACAGCGTGC-CAACTATGC-3'); для гена GjAPDH - F (5'-TTAG-CACCCCTGGCCAAGG-3') и R (5'-CTTACTC-CTTGGAGGCCATG-3').

Реакции ОТ-ПЦР проводили на приборе StepOnePlus™ Real-Time PCR System ("Applied Biosystems", США) в следующем режиме: сегмент 1 (денатурация) — 95°С, 10 мин; сегмент 2 (амплификация с измерением флуоресценции) — 95°С, 1 мин; 65°С, 1 мин; 72°С, 1 мин (45 циклов); сег-

мент 3 — построение кривой плавления продуктов амплификации. Каждый образец анализировали трижды. Все образцы опухоли и прилежащей ткани выравнивали по уровню транскрипта гена GAPDH. Для оценки уровня РНК в качестве внутреннего контроля при проведении ОТ-ПЦР использовали ген GAPDH. Согласно данным литературы, уровень мРНК гена GAPDH в опухоли пищевода не более чем в 1.5 раза отличается от его уровня в прилежащей ткани [20]. Ранее показано, что в рассматриваемых образцах опухоли легкого уровень мРНК гена GAPDH не более чем в два раза отличается от уровня в прилежащих тканях [21, 22]. Учитывая выявленную биологическую вариабельность контрольного гена, при анализе данных мы рассматривали изменения уровня мРНК тран-скриптов гена S

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком