РАЗЛИЧИЯ АКТИВНОСТИ НОНСЕНС-ОПОСРЕДОВАННОЙ ДЕГРАДАЦИИ МРНК В ЛИНИЯХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ВЫЯВЛЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО РЕПОРТЕРА

ГУРСКАЯ Н.Г.; ЛУКЬЯНОВ К.А.; МАТЛАШОВ М.Е.; ПЕРЕВЕРЗЕВ А.П.; СТАРОВЕРОВ Д.Б.

ш

БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2015, том 41, № 5, с. 587-591

УДК 577.21

РАЗЛИЧИЯ АКТИВНОСТИ НОНСЕНС-ОПОСРЕДОВАННОЙ ДЕГРАДАЦИИ мРНК В ЛИНИЯХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ, ВЫЯВЛЕННЫЕ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО РЕПОРТЕРА1

*ФГБУНИнститут биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

117997, Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 **Нижегородская государственная медицинская академия, 603005, Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, 10/1 Поступила в редакцию 24.03.2015 г. Принята к печати 14.04.2015 г.

Исследована активность каскада нонсенс-опосредованной деградации мРНК (nonsense-mediated mRNA decay, NMD) в нескольких культурах клеток млекопитающих. Анализ проводили с помощью недавно разработанного нами генетически кодируемого флуоресцентного сенсора [Pereverzev et al. Sci. Rep. 2015. V. 5. P. 7729]. Данный флуоресцентный NMD-репортер позволяет оценить активность NMD в единичных живых клетках по соотношению сигналов зеленого и красного флуоресцентных белков. Были проанализированы следующие клеточные линии: карцинома толстой кишки мыши CT26, карцинома легких Льюиса мыши LLC, Т-клеточный лейкоз человека Jurkat, спонтанно им-мортализованная неонкогенная линия кератиноцитов человека HaCaT. Данные клеточные линии показали сильно различающуюся активность NMD. В клетках CT26 активность NMD была низкой, а в клетках LLC — высокой (в 8.5 раз выше, чем в CT26). Клетки Jurkat и HaCaT проявляли сильную гетерогенность и включали в себя две субпопуляции клеток, обладающих низкой и высокой активностью NMD. Кроме того, для первичной культуры нейронов из гиппокампа эмбрионов мыши была показана высокая активность NMD.

Ключевые слова: генетически кодируемый сенсор, NMD, флуоресцентный белок, культура клеток.

DOI: 10.7868/S0132342315050115

ВВЕДЕНИЕ

Нонсенс-зависимая деградация (NMD) мРНК является эволюционно консервативным механизмом разрушения транскриптов с преждевременными стоп-кодонами [1]. NMD устраняет аберрантные мРНК, появляющиеся в результате мутаций, альтернативного сплайсинга или перестроек ДНК в иммунных клетках [2]. Считается, что основной функцией NMD является снижение количества укороченных с С-конца белков, потенциально ток-

1 Статья публикуется по материалам сообщения, представленного на VII Российском симпозиуме "Белки и пептиды"; Новосибирск, 12—17 июля 2015 г.

Сокращения: CT26, colon carcinoma (карцинома толстой кишки), GFP, green fluorescent protein (зеленый флуоресцентный белок), LLC, Lewis lung carcinoma (карцинома легких Льюиса), MEF, mouse embryonic fibroblasts (эмбриональные фибробласты мыши), mES, mouse embryonic stem cells (эмбриональные стволовые клетки мыши), NMD, nonsense-mediated mRNA decay (нонсенс-опосредованная деградация мРНК). #Автор для переписки (тел.: +7(499) 724-81-22; e-mail: ngurskaya@mail.ru).

сичных для клетки. Кроме того, как было недавно показано, мишенями этого процесса являются и многие нормальные транскрипты, стоп-кодоны в которых распознаются как преждевременные [3].

Недавние исследования показали, что активность NMD регулируется под действием различных механизмов, включая специфические микроРНК и концентрацию ионов кальция [4, 5]. Таким образом, NMD функционирует как механизм глобальной регуляции экспрессии множества генов в таких биологических процессах, как дифференцировка клеток, эмбриональное развитие, выживание клеток в условиях стресса и канцерогенез.

Недавно мы разработали новый неинвазивный метод количественной оценки NMD с помощью флуоресцентных белков [6]. Метод основан на использовании двух бицистронных генетических конструкций, названных pNMD+ и pNMD—, каждая из которых кодирует зеленый (TagGFP2) и дальнекрас-ный (Katushka) флуоресцентные белки (оба под контролем CMV-промоторов). В конструкции pNMD+ транскрипт, кодирующий TagGFP2, подвергается

588

ПЕРЕВЕРЗЕВ и др.

pNMD+

(а)

101 102 103 TagGFP2

104 (б)

101 102 103 TagGFP2

м

104

101 102 103 TagGFP2

104 (г)

101 102 103 TagGFP2

104

pNMD-

101 102 103 104 TagGFP2

Рис. 1. Результаты проточной цитофлуориметрии клеток, временно трансфицированных векторами pNMD+ (слева) или pNMD— (справа). Каждая точка на бивариантном плоте показывает интенсивность флуоресценции клетки в зеленом (горизонтальная шкала) и красном (вертикальная шкала) каналах детекции. Для удобства сравнения клеточных популяций между собой, области соответствующих контрольных клеток pNMD— обведены серыми пунктирными линиями. (а) CT26, (б) LLC, (в) Jurkat, (г) HaCaT.

деградации по механизму сплаисинг-зависимого NMD, а в конструкции pNMD— остается стабильным. Распад мРНК, кодирующей TagGFP2, можно количественно оценить по уменьшению отношения интенсивности зеленой флуоресценции к интенсивности красной флуоресценции в клетках, экспрессирующих pNMD+, по сравнению с клетками, экспрессирующими pNMD—.

Важно отметить, что прямое сравнение данных, полученных с помощью флуоресцентного репортера NMD, с результатами количественной ПЦР на тех же клетках показало совпадение оценок эффективности NMD этими методами как в норме, так и при воздействии различных ингибиторов NMD [6]. Это доказывает адекватность оценки NMD с помощью нового метода. Важным преимуществом флуоресцентного репортера перед классическими методами (ПЦР, Нозерн-блот) является возможность анализа на уровне единичных живых клеток, что позволяет, в частности, выявлять гетерогенность активности NMD внутри клеточных популяций.

В данной работе мы применили флуоресцентный репортер NMD для анализа активности этого каскада в различных линиях клеток млекопитающих.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Флуоресцентный репортер NMD был использован для анализа следующих клеточных линий: карцинома толстой кишки мыши CT26, карцинома легких Льюиса мыши LLC, Т-клеточный лейкоз человека Jurkat, спонтанно иммортализован-ная неонкогенная линия кератиноцитов человека HaCaT. Клетки каждой линии были трансфици-рованы векторами pNMD+ или pNMD— и проанализированы с помощью проточной цитофлуо-риметрии.

Как и ожидалось, контрольные клетки, экс-прессирующие pNMD—, проявляли яркую зеленую и красную флуоресценцию. На бивариант-ном плоте, где интенсивность сигналов в зеленом и красном каналах детекции отложены по горизонтальной и вертикальной осям соответственно, это давало диагональное распределение клеток (рис. 1). С помощью pNMD— контролей вычисляли отношение зеленого и красного сигналов, характерное для данных систем без влияния NMD.

В клетках, экспрессирующих pNMD+, области диагонального распределения клеток были смещены влево (по сравнению с клетками pNMD—), что соответствовало уменьшению зеленого сигнала вследствие деградации кодирующей TagGFP2 мРНК-мишени NMD. Величину этого смещения использовали как количественную характеристику активности каскада NMD в данных клетках.

0

Анализируемые клеточные линии показали различную активность NMD (рис. 1 и таблица). В клетках CT26 активность NMD была низкой, как следовало из уменьшения количества TagGFP2 по сравнению с контролем всего в 2 раза (рис. 1а). Клетки LLC демонстрировали высокую активность NMD, снижающую количество TagGFP2 в 17 раз (рис. 1б). Клетки Jurkat проявляли сильную гетерогенность; можно было выделить две субпопуляции клеток, обладающих низкой или высокой активностью NMD (рис. 1в). Для клеток HaCaT была обнаружена сходная гетерогенность по активности NMD (рис. 1г).

Далее мы провели анализ NMD в первичной культуре нейронов из гиппокампа 17-дневных эмбрионов мыши. На 5-й день культивации нейроны трансфицировали векторами pNMD+ или pNMD—, а на 20-й день анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии в зеленом и красном каналах детекции (рис. 2). Соотношение интенсивностей сигналов TagGFP2 и Katushka в телах нейронов использовали как меру активности NMD, аналогично тому, как описано выше для цито-флуориметрии культур иммортализованных клеток. Активность NMD составила 14 ± 2.7 раз. Полученные результаты показывают, что в культуре первичных гиппокампальных нейронов эмбрионов мыши идет активный процесс NMD на приблизительно таком же уровне, как в культурах HEK293T и HeLa (таблица).

В данной работе мы показали, что различные клеточные культуры характеризуются разным уровнем активности каскада NMD, который может различаться в несколько раз. Так, уменьшение сигнала TagGFP2 в клетках CT26 составляло всего 2 раза, что в 8.5 раз ниже активности NMD в клетках LLC (таблица). Линии CT26 и LLC являются удобной моделью развития перевиваемых опухолей на сингенных линиях мышей. Благодаря низкой активности NMD в CT26 и высокой в LLC эти клетки могут быть использованы для поиска веществ, усиливающих или ослабляющих активность NMD соответственно, как в клетках in vitro, так и в опухолях in vivo.

Особенно интересным фактом является ярко выраженная гетерогенность функционирования каскада NMD в клетках линий Jurkat и HaCaT. Ранее сходная гетерогенность с появлением популяции клеток с низкой активностью NMD была выявлена нами в клетках HEK293T в условиях длительного культивирования на чашке [6]. Предположительно, снижение активности NMD в части клеток HEK293T может быть связано с клеточным стрессом в областях высокой плотности клеток. В случае Jurkat и HaCaT клетки росли в нормальных условиях, следовательно, существование субпопуляций клеток со сниженной активностью NMD было вызвано другими причинами. Дальней-

Активность каскада NMD в различных клетках, измеренная с помощью флуоресцентного репортера pNMD+/-

Клетки Активность NMD, раза

популяция 1 популяция 2

HEK293T6 15.3 ± 1.2 -

HEK293T6'в 12.8 ± 2.1 2.8 ± 1.0

HeLa6 14.4 ± 1.3 -

MEF6 8.9 ± 2.0 -

mES6 8.3 ± 1.5 -

CT26 2.0 ± 0.4 -

LLC 16.9 ± 3.0 -

Jurkat 9.7 ± 1.2 1.6 ± 0.1

HaCaT 15.0 ± 2.1 2.4 ± 0.3

Нейроны мыши 14.0 ± 2.7 -

а Уменьшение сигнала TagGFP2 (число раз) в клетках с рКМВ+ по сравнению с клетками с рКМС—, по данным трех независимых экспериментов. б Данные из

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.