научная статья по теме РАЗЛИЧНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ НЕЙРОНОВ РЕЛЕВАНТНЫХ СТРУКТУР МОЗГА КРЫС ИЗБИРАТЕЛЬНО ВОВЛЕКАЮТСЯ В ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ПАМЯТИ Медицина и здравоохранение

Текст научной статьи на тему «РАЗЛИЧНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ НЕЙРОНОВ РЕЛЕВАНТНЫХ СТРУКТУР МОЗГА КРЫС ИЗБИРАТЕЛЬНО ВОВЛЕКАЮТСЯ В ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ПАМЯТИ»

НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 4, с. 314-320

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

УДК 577.152

РАЗЛИЧНЫЕ ПОПУЛЯЦИИ НЕЙРОНОВ РЕЛЕВАНТНЫХ СТРУКТУР МОЗГА КРЫС ИЗБИРАТЕЛЬНО ВОВЛЕКАЮТСЯ В ОБЕСПЕЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ПАМЯТИ

© 2013 г. В. В. Шерстнев1, М. А. Грудень1, *, Ю. И. Александров2, З. И. Сторожева1,

О. Н. Голубева1, А. Т. Прошин1

1ФГБУ "Научно-исследовательский Институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина"РАМН

2ФГБУ "Институт психологии" РАН

С помощью иммуногистохимического метода исследовали экспрессию транскрипционного фактора е-Ю в клетках, синтезирующих нейронспецифические белки и калбиндин Б-28К в гиппокам-

пе, черве мозжечка, моторной и ретроспениальной коре мозга крыс после обучения навыку нахождения скрытой платформы в водном лабиринте. Выявляли также апоптотические нервные клетки экс-прессирующие Обнаружены значимые различия внутри и межструктурного распределения

— и калбиндин-позитивных нейронов, экспрессирующих е-Ю у обученных и контрольных животных. Выявлена взаимосвязь количества экспрессирующих е-Ю нейронов, меченных в ре-троспениальной коре мозга, с показателями упрочения долговременной пространственной памяти. Предполагается, что полученные результаты свидетельствуют об избирательном вовлечении нервных клеток различных популяций нейронов, локализующихся в релевантных структурах головного мозга крыс в обеспечение процессов долговременной пространственной памяти.

Ключевые слова: обучение, долговременная память, экспрессия ранних генов, с-/оя, нейрональные маркеры, ЫвыМ, калбиндин В-28К.

Б01: 10.7868/81027813313040080

ВВЕДЕНИЕ

Актуальным аспектом современных исследований системных и клеточно-молекулярных механизмов обучения и памяти является выяснение морфологических и нейрохимических характеристик, возраста и структурного распределения нейронов, вовлеченных в обеспечение когнитивных процессов [1—3]. Одним из подходов для экспериментальной разработки указанных задач является иммуногистохмическое выявление синтезирующих определенные нейронспецифические белки клеток, которые активируются при обучении в различных структурах мозга и могут быть визуализированы по экспрессии ранних генов.

В качестве специфических нейрональных маркеров широко используют ядерный белок нервных клеток и калбиндин Э-28К (КБ). об-

наруживается лишь в нервной ткани, локализуясь в ядрах и перинуклеарной цитоплазме большинства нейронов центральной и переферической нервной системы млекопитающих и человека. В глиальных клетках не определяется. Одна-

ко в норме этот белок не экспрессируется в ряде

* Адресат для корреспонденции: 125009 г. Москва, ул. Моховая, 11, стр. 4, тел.: (495) 601-21-30, e-mail: m.gruden@nphys.ru.

нейронов, таких как клетки Кахаля—Ретциуса не-окортекса; клетки Пуркинье, клетки Гольджи, клетки Лугаро и нейроны зубчатого ядра мозжечка; нейроны нижних олив; митральные клетки обонятельных луковиц и некоторые другие типы нервных клеток. Синтез белка начинается в

постмитотических нейробластах на ранних стадиях дифференцировки [4, 5]. Известно, что КБ относится к группе Са2+-свзывающих нейроспе-цифических белков и выявляется в цитоплазме и ядрах определенных типов нервных клеток мозга млекопитающих и человека.

Экспрессия этого белка начинается на более поздних, по сравнению с стадиях диффе-

ренцировки нейронов. Показано, что КБ синтезируется в отдельных немногочисленных популяциях нервных клеток. Так, в неокортексе крыс КБ-позитивные нейроны составляют около 5% от общего числа нервных клеток и большей частью представляют собой однородную популяцию интернейронов, локализующихся в 1, 2, 3 оливах коры мозга.

Белок КБ обнаруживается в гранулярных клетках зубчатой фасции, в интернейронах СА2-СА4 и некоторых пирамидных нейронах СА1-СА2 полей гиппокампа. В мозжечке КБ экспрессируется

лишь в клетках Пурькинье и отдельных клетках Гольджи [6, 7].

Таким образом, особенности экспрессии указанных белков в определенных типах нервных клеток позволяют использовать их для картирования мест локализации различных нейрональ-ных популяций.

Надежным молекулярным маркером пластических перестроек нервных клеток, вовлеченных в процессы обучения и формирование долговременной памяти, считают индуцированную экспрессию раннего гена с-/оз. Убедительно показано, что экспрессия данного гена сопряжена с пластическими изменениями нейронов при различных формах обучения, а подавление синтеза белка с-Ю вызывает нарушение долговременной памяти [8,9]. Следует также отметить, что детекцию и КБ часто применяют в экспериментальных исследованиях процессов нейрогенеза, протекающих в зрелом мозге, для выявления вновь образованных нервных клеток различного возраста и оценки участия этих нейронов в обеспечении механизмов обучения и памяти [10, 11].

В связи с изложенным выполненная нами работа направлена на исследование особенностей вовлечения различных популяций нейронов, локализующихся в релевантных структурах мозга крыс, в обеспечении процессов долговременной пространственной памяти. В гиппокампе (ГП), черве мозжечка (ЧМ), моторной (МК) и ретро-спениальной (РК) коре мозга были выявлены и оценены различия в составе и числе меченных и КБ нервных клеток, экспрессирующих с-Юб после обучения животных навыку нахождения скрытой платформы в водном лабиринте.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены на взрослых крысах-самцах линии ^з1аг (п = 20) 8-месячного возраста массой тела 450—470 г. (питомник лабораторных животных "Столбовая" НЦБМ, РАМН) с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества (86/609 ЕС), а также в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (ФГБУ "Научно-исследовательского института нормальной физиологии им. П.К. Анохина" РАМН, протокол № 1 от 03.09.2005 г). Животные на протяжение двух недель до начала эксперимента были адаптированы к условиям вивария института. Крыс содержали по три особи в клетках в условиях свободного доступа к пище и воде при постоянной комнатной температуре +21 ± 1°С и 12-часовом световом режиме.

Обучение животных (п = 7) проводили в пространственном водном лабиринте, который представлял собой круглый бассейн диаметром 160 см

и высотой 60 см с серой внутренней поверхностью, наполненный водой (23 ± 2° С) до высоты 40 см. Расположение в бассейне прозрачной платформы диаметром 9 см, находившейся на 2 см ниже поверхности воды, как и обстановочных стимулов в экспериментальной комнате, было постоянным. Крыс обучали в течение 4 дней с перерывом между сеансами в 24 ч. Во время сеанса животных помещали в воду с четырех разных случайно выбранных точек. После достижения платформы животного оставляли на ней на 30 с, затем помещали в домашнюю клетку на 60 с (до начала следующей пробы). Крыс, не нашедших платформу за 60 с, мягко направляли к ней. В каждой пробе фиксировали время, необходимое для достижения платформы. Животных группы "активный контроль" (n = 7) подвергали принудительному плаванию в отсутствие платформы по описанному ранее протоколу. При этом время плавания в контрольной группе соответствовало времени, проведенному в воде обучавшимся животным, т.е. каждому обучавшемуся животному по времени и паттерну плавания соответствовала одна "контрольная" особь. Группу "пассивный контроль" (n = 6) составили крысы постоянно находившиеся в домашних клетках.

Животных декапитировали спустя 5 мин по окончанию последнего сеанса обучения или процедуры принудителного плавания. Крыс, находящихся в домашних клетках ("пассивный контроль") декапитировали в тот же день, что и крыс других групп. Мозг всех животных извлекали из черепной коробки, замораживали в жидком азоте и хранили при —80°C. В последуюшем готовили фронтальные срезы толщиной 20 мкм на криоста-те HR 400 (Микром, Германия). Границы анализируемых церебральных структур, принимающих непосредственное участие в обеспечении исследуемой формы памяти, определяли в соответствии c атласом мозга крысы [12]: ГП (от —2.80 до —4.30 мм относительно Брегмы), МК (+2.5 до +3.5 мм от Bregma), РК (—4.0 to до —5.0 мм от Bregma), ЧМ ( —10.52 до —11.6 мм от Bregma). Общее количество срезов мозга на одно животное составило: ГП и РК (n = 75), МК (n = 100), ЧМ (n = 50). Серийные срезы мозга фиксировали в 4%-ном параформальдегиде и подвергали им-мунофлюоресцентному окрашиванию на синтезируемый белок с-Fos, маркер развивающихся и зрелых нейронов — белок NeuN, маркер зрелых нейронов — белок калбиндин-Э28К и маркер апоптоза — специфические фрагменты ДНК (ApoDNA). Для выявления NeuN — позитивных клеток в качестве первичных антител использовали моноклональные антитела мыши к NeuN, конъюгированные с биотином (US Biological, USA) в разведении 1 : 100 с последующей обработкой стрептавидином (в разведении 1 : 100) и

50 40 30 20 10

*&

Рис. 1. Динамика формирования пространственного навыка в лабиринте Морриса у крыс По оси

абсцисс — дни обучения, по оси ординат — среднее время достижения платформы в сеансе обучения, выраженное в секундах (с). * р < 0.05 по сравнению с первым днем обучения, & р < 0.05 по сравнению со вторым днем обучения.

окрашиванием срезов конъюгатом флюоресцентного красителя тирамида с антителами кролика к стрептавидину(Регкт Elmer,USA). КБ-позитив-ные клетки выявляли инкубированием с кроличьими афиино-очищенными поликлональными IgG к калбиндину-Э28К (Chemicon, USA) с последующим использованием флюоресцентной метки Alexa-Fluor 568, конъюгированной с ослиными моноклональными антитела к IgG кролика. Для выявления количества клеток экспрессирую-щие белок с-fos фиксированные срезы мозга крыс отмывали (3 раза по 5 мин) 0.1 М фосфатным буфером, pH 7.4, помещали в 2.5%-ный раствор нормальной сыворотки осла для блокирования неспецифического связывания на 30 мин. Затем срезы подвергали инкубации с кроличьими поли-клональными антителами против c-fos (Calbio-chem, USA), в разведении 1 : 2000 в течение 18 ч, после чего их отмывали (6 х 5 мин) 0.3% Triton X-100 на 0.1 М фосфатном буфере, pH 7.4. Срезы обрабатывали биотинилированными козьими вторичными антителами против кролика (Vector Laborato

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком