БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 2, с. 253-261
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 535.343.32:( 577.322.5+577.336)
РАЗЛОЖЕНИЕ УФ-СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА НА СПЕКТРЫ ПОГЛОЩЕНИЯ ПРОСТЕТИЧЕСКИХ ГРУПП И АПОБЕЛКА С ПОМОЩЬЮ АДДИТИВНОЙ МОДЕЛИ
© 2015 г. И .А. Лавриненко, Г.А. Вашанов, В.Г. Артюхов
Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская площадь, 1
E-mail: box _624@ $т1р.гы Поступила в p едакцию 07.05.14 г.
П редложен и обоснован способ разложения УФ-спектра поглощения гемоглобина на спектры поглощения белковой и небелковой составляющих с помощью аддитивной модели. Установлено, что в диапазоне длин волн 240-320 нм гемовая компонента белка имеет полосу поглощения с A,max = 269,2 нм (е = 97163), апобелковая компонента - полосу с Amax = 278,4 нм (е = 48669). Определена интегральная относительная доля поглощения гемовой (78,8%) и апобелковой (21,2%) частей в спектре гембелка в указанном диапазоне длин волн.
Ключевые слова: хромопротеид, гемоглобин, апобелок, аминокислотные остатки, простетическая группа, аддитивная модель спектра.
Большую роль в поддержании нативной структуры и функционировании сложных белков играют прочно связанные с ними просте-тические группы. Среди белков, содержащих такие гр уппы, хромопр отеиды занимают особое положение, так как они обладают интенсивными полосами поглощения в ближнем УФ - и видимом диапазонах спектра. Это обстоятельство позволяет широко использовать методы спектрального анализа при исследовании структурно-функциональных свойств данных макромолекул [1-5].
Вместе с тем из-за перекрытия спектров поглощения простетических групп и апобелка в средневолновом УФ-диапазоне изучение спектральных свойств этих частей хромопротеида в составе макромолекулы затруднено [6].
Разделение физико-химическими методами белка на отдельные составляющие зачастую приводит к весьма ненадежным результатам исследований вследствие нарушения системы внутримолекулярных взаимодействий. П ри этом изменения в локальном окружении хро-мофоров зачастую влекут за собой соответствующие изменения их спектральных свойств. В конечном итоге дезинтеграция макромолекулы может приводить, например, к окислению суль-гидрильных групп апобелка или железа про -стетических групп, т.е. затрагивается непосредственно структура хромофоров [7,8].
Таким обр азом, выделение той или иной составляющей биополимера вызывает различ-
ную по степени модификацию частей макро -молекулы, что ведет к различию в спектрах поглощения изолированных белковой и небелковой компонент относительно их спектр ов поглощения в нативной макромолекуле.
Возможным путем исследования спектров поглощения различных типов хромофорных групп, входящих в состав полипептида, является разложение его интегрального спектр а поглощения математическими методами, которые лишены рассмотренных недостатков (но имеют, безусловно, свои ограничения).
И сходя из вышеизложенного, нами предло -жен способ разложения УФ -спектра поглощения гемоглобина на составляющие светопогло-щения белковой и небелковой компонент в диапазоне длин волн 240-320 нм с помощью аддитивной модели. В ходе работы найдена относительная доля поглощения апобелка и ге-мовых групп как функция от длины волны, а также интегральная относительная доля их поглощения в указанном диапазоне длин волн.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
И спользованы раствор ы гемоглобина человека, полученные из крови донор ов в 0,1 моль/л Na-фосфатном буфере (Sigma, США) с рН 7,4 [9]. Концентрация гембелка (2,0-10-5 моль/л) определена спектрофотометрически по значениям поглощения при 500, 569 и 577 нм [10,11].
Раствор ы ароматических, гетер оцикличе-ских и серосодержащих L-аминокислот получены из кр исталлических коммерческих препа -ратов (Ajinomoto, Япония) с содержанием основного вещества более 98,5%. Концентрация (моль/л) фенилаланина - 3,3-10-3, тирозина -3,3-10-4, триптофана - 1,2-Ю"4, гистидина -9,2-10-2, цистеина - 6,9-10-2 и метионина - 1,0-10-1 в 0,1 моль/л Na-фосфатном буфере (рН 7,4). Во избежание возможного окисления SH-груп-пы цистеина применяли деаэрированный буфер в атмосфере гелия.
Спектры поглощения исследуемых образцов в диапазоне 230-320 нм зарегистрированы на спектр офотометре UV-2401(PC) (Shimadzu, Япония), спектральная ширина щели 0,5 нм, шаг сканирования 0,5 нм, скорость сканирования соответствовала режиму Slow. Измерения про -ведены в стандар тной кварцевой кювете Hellma (QS, Германия) с длиной оптического пути 10 мм.
С целью снижения случайных ошибок фотометрических измерений, обусловленных тепловым шумом фотодетектора, спектры поглощения сглаживались и интерполировались кубическими сплайнами (СиЫс Spline Smoothing) [12,13] с точностью аппроксимации до 0,2 нм. Уменьшение фотометрической ошибки базовой линии спектр офотометра, а также ошибки, обусловленной асимметрией кювет, обеспечивалось путем регистрации спектров поглощения образцов в режиме Split-beam. Увеличение разрешения в их спектрах поглощения достигалось вычислением второй производной [14].
И сходная модель спектр а поглощения апо-гемоглобина получена путем сложения парциальных спектров молярного поглощения фенил-аланина, тирозина, триптофана, гистидина, цис-теина и метионина в соотношении 30:12:6:38:6:6 по данным аминокислотного состава этого белка (PDB 1BZ0) [15,16].
Необходимые вычисления выполнены с помощью программы MiCTosoft Ехсе! с модулем Visual Bas^ for Applications (MiCTosoft, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В основу предлагаемого способа разложения интегрального спектра поглощения хр омо-протеида на белковую и небелковую составляющие положен следующий алгоритм с опр е-деленными условиями и допущениями.
1. Вклад белковой и небелковой компонент в спектр поглощения белка представляется аддитивной моделью общего вида:
А + B = C,
(1)
где А и В - взаимосвязанные спектры поглощения апобелка и его простетических групп, которые необходимо найти, а С - известный спектр поглощения полипептида.
2. И спользуемый диапазон длин волн должен быть практически свободен от поглощения пептидными группами белка.
3. В качестве исходной модели спектра поглощения апобелка (А 0) используется аддитивная модель спектра, которая получена в результате суммирования парциальных спектров поглощения аминокислот, входящих в со став макромолекулы.
4. И сходная модель спектр а поглощения небелковой компоненты (В о) получается вычитанием А 0 из С.
5. Повышение степени соответствия модельного спектра А о к целевому спектр у А достигается смещением А о по оси абсцисс на величину, необходимую для компенсации сдвига относительно спектра С (его апобелковой со -ставляющей). В результате вычислений получается смещенный на Ах модельный спектр А1.
6) П редполагается [6,17,18], что существующая разница в интенсивности, шир ине и форме полос поглощения боковых групп аминокислот для спектров А о и А не столь значительна и может быть нивелирована аппроксимацией (п. 10 и 11 алгоритма).
7. Необходимая величина спектрального сдвига (Ах) задается формальным критерием.
8. Полученный вычитанием спектра А1 из С спектр В1 используется, в том числе, как тест на корректность и эффективность трансформации спектр а А 0.
9. Эмпир ическим критерием оптимально заданной величины Ах по этому тесту является минимальное присутствие «отпечатков» полос поглощения хромофоров аминокислотных остатков в модельном спектре В^
10. Для устранения дефектов спектр а В1, обусловленных остаточным присутствием «следов» полос поглощения хромофоров аминокислот, выполняется его аппроксимация по заданному критерию. В результате получается итоговый модельный спектр поглощения просте-тических групп (В).
11. Вычитанием В из С рассчитывается итоговый модельный спектр поглощения апобелка (А).
12. Сравнением вторых производных спектров А и В (их экстремумов) осуществляется оценка корректности выполненных преобразований.
Рис. 1. (а) - Спектры поглощения раствора гемоглобина в диапазоне длин волн 240-320 нм (спектр 1) и исходной модели спектр а по апобелку (спектр 2); (б) - модели спектр ов поглощения по апобелку в диапазоне длин волн 250-300 нм - исходная (спектр 1), со смещением по шкале длин волн (спектр 2), по шкале волновых чисел (спектр 3), зависимость ушир ения смещенного по волновому числу спектр а относительно спектр а со смещением по длине волны (спектр 4); зависимость коэффициента корреляции от шага смещения по исходному спектру (в) и его второй производной (г) по шкале длин волн (спектры 1), волновых чисел (спектры 2). Области положительного и отр ицательного ушир ения спектр а (б) показаны знаком «+» и «-» соответственно.
Мы протестировали предложенный алго-р итм.
Для этого были рассчитаны показатели моляр ного поглощения для спектр а гемоглобина в исследуемом диапазоне длин волн (рис. 1а, спектр 1). Путем суммирования парциальных спектр ов поглощения аминокислот создана аддитивная модель спектр а поглощения апоге-моглобина (компонента А 0) (р и с. 1а, спектр 2; р ис. 1б, спектр 1) [19]. Вычитанием из спектр а поглощения гемоглобина (спектр С в модели (1)) спектр а А 0 получена модель спектр а поглощения гемовой компоненты (В0) (рис. 2а, спектр 1). П редварительный анализ показал, что спектр пр о стетических групп имеет, вер о -ятно, одну полосу поглощения. Наблюдаемые возмущения в спектре В0 (рис. 2а, спектр 1) пр едставляют собой ожидаемые дефекты, обу-
словленные разностью в положении пер еходов в спектр ах поглощения боковых групп аминокислот в со ставе макр омолекулы (целевой спектр А) относительно таких пер еходов в спектр е А 0.
Пр и смещении по абсциссе спектр а А 0 относительно С необходимо выработать критерий (п. 7 алгоритма), на основании которого будет задано численное значение для такого сдвига.
В качестве простого критерия, используемого для вычисления Ах, может выступить разность пиков поглощения двух спектр ов: белка (гемоглобина) с ^тах= 274,2 нм и модели спектр а апобелка (А 0) с Хтах = 275,6 нм. Значение Ах со ставило -1,4 нм, что не согласует ся с полученными ранее данными по ра створ ам альбумина [5] и результатам наших исследований [19]. Таким обр азом, в от
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.