ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 2, с. 144-151
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 631.46
РАЗМЕРЫ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ В ПОЧВАХ, ОПРЕДЕЛЯЕМЫЕ МЕТОДОМ "КАСКАДНОЙ" ФИЛЬТРАЦИИ © 2013 г. Л. М. Полянская, Р. Б. Городничев, Д. Г. Звягинцев
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, ф-т почвоведения, 119991 Москва, Ленинские горы, 1, cmp. 12 E-mail: lpolyanskaya@mail.ru Поступила в редакцию 22.06.2011 г.
Изучена численность бактерий в черноземе типичном и горно-луговой почве традиционным методом и методом каскадной фильтрации. Общая численность бактерий в этих почвах, полученная на фильтрах разного диаметра при фильтрации суспензии определенного объема, в 1.5—5 раз выше, чем полученная традиционным методом. В структуре биомассы бактерий в обеих почвах на 8—90% доминировала биомасса бактерий с диаметром клеток 0.38—0.43 мкм. В типичном черноземе биомасса клеток с диаметром 0.17 мкм составила чуть больше 1%, в горно-луговой почве процент биомассы клеток с диаметром 0.17 мкм возрос до 5%. Рассчитаны средний объем и диаметр бактерий в изученных почвах. В типичном черноземе средний объем бактериальных клеток равнялся 0.0046 мкм3, а диаметр — 0.206 мкм. В горно-луговой почве эти показатели были чуть ниже — 0.0038 мкм3 и 0.194 мкм соответственно. Биомасса бактериальных клеток, которая обычно вычисляется на основе объема клетки 0.1 мкм3, завышена при подсчете численности на фильтрах примерно в 5 раз. Процент реальной биомассы почвенных бактерий существенно ниже традиционно рассчитанной.
DOI: 10.7868/S0002332913010128
В последние годы XX в. особое внимание было обращено на мельчайшие формы жизни на нашей планете — бактерии, имеющие размеры, измеряемые нанометрами. Фолк (Folk, Linch, 1997) называет нанобактериями карликовые (миниатюрные) формы бактерий с диаметром 0.05—0.2 мкм. Теоретические расчеты, основанные на содержании в клетках минимального количества ДНК, энзимов, липидов и рибосом, показывают на невозможность существования живых клеток диаметром меньше, чем 0.2 мкм. Есть сведения (Himmelreich et al., 1996; Mushegian et al., 1996), что теоретически минимальный диаметр для живой клетки может быть около 0.14 мкм. Причем для компактного размещения всех необходимых для клетки компонентов нужна сферическая форма (Maniloff, 1997). По мнению некоторых ученых для саморепликации и основного метаболизма клеток нужно приблизительно 250 генов. Это половина самого меньшего известного в настоящее время бактериального генома. Исходя из этого, шаровидная клетка должна быть 100 нм в диаметре, а добавив к этому место для рибосом и других структур получим 200 нм. По расчетам (Volke, 1997) диаметр сферической клетки может быть всего 50 нм. Однако во многих образцах из озер, рек, почвы, снега и дождевой воды с помощью эпифлюоресцентного микроскопа было обнаружено, что 0.2 мкм — наименьший диаметр бактериальной клетки (Maniloff, 1997).
Предполагают, что малый размер бактерий в почве определяют естественные условия, которые лимитируют их развитие питательными веществами или стрессовыми факторами. Образование нанобактерий как ответной реакции клетки на неблагоприятные условия среды и стресс-факторы изучено на поведении тривиальных форм бактерий в лабораторных опытах. Культивирование полученных наноформ на богатых питательных средах приводит к возврату их к исходным формам (Vainshtein et al., 1998; Вайнштейн и др., 2007). Нанобактерии существуют везде (Ka-jander et al., 1997; Kajander, 1998; Kajander, Ciftcio-glu, 1998). Ученые предполагают, что сейчас нанобактерии являются широко распространенной формой жизни на нашей планете. Они находятся в воздухе, обнаружены в минералах, в почвах, в атмосфере, в грозовых тучах и т.д. (Folk, 1993).
Большинство полученных данных касаются констатации наличия клеток ультрабактерий или нанобактерий в почве и других местообитаниях (Panikov, 2005; Дуда и др., 2007; Дмитриев и др., 2008), но нет данных о численности разных по размеру бактерий в почве.
Цель работы — определение методом каскадной фильтрации в сочетании с люминесцентной микроскопией размеров клеток в почвах двух типов, их общей численности и биомассы, а также проведение сравнения размеров бактерий в почве
и в чистых культурах на жидкой питательной среде, и установление жизнеспособности мелких клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали образцы чернозема типичного, находящегося под целинной растительностью (Центрально-черноземный государственный природный биосферный заповедник им. Алехина, Курская обл.). Детальное морфологическое описание профиля и основные аналитические характеристики данной почвы широко представлены в литературе (Марголина и др., 1988). Почва характеризуется высоким содержанием органического углерода (3.96%, слой 10—20 см горизонта А), рН 7-7.5.
Образцы горно-луговой субальпийской почвы были отобраны из-под разнотравного горного пастбища (Кавказский государственный заповедник). Растительность субальпийская сильно сбитая, поверхность почвы уплотнена в результате рекреационной нагрузки и выпаса скота.
В работе использовали свежие образцы гумусовых горизонтов этих почв (0-15 см).
Для предварительной обработки образцов почв для микробиологического анализа применяли ультразвуковое диспергирование на низкочастотном диспергаторе типа УЗДН-1 (Россия) — 22 кГц, 0.44 А, 2 мин (Звягинцев, 1968).
Общее число микроорганизмов в почвах определяли методом люминесцентной микроскопии по стандартной методике. Препараты готовили обычным способом (Методы ... , 1991). Суспензии образцов почвы наносили микропипеткой на тщательно обезжиренные предметные стекла (0.02 мл на препарат) и равномерно распределяли петлей на площади 4 см2. Фиксирование препаратов на пламени горелки проводили после полного их высыхания. Для одного образца готовили 12 препаратов.
Через фильтр пропускали окрашенную акридином оранжевым (1 : 1000, в течение 2—3 мин) суспензию, учитывали клетки бактерий на трех фильтрах, расчет числа клеток на 1 г почвы проводили по формуле:
N = S1an/vS2с,
где: N — число клеток на 1 г почвы; S1 — площадь фильтра, мкм2; a — количество клеток в одном поле зрения (усреднение производится по всем фильтрам); п — показатель разведения почвенной суспензии (мл); V — объем профильтрованной через фильтр суспензии, мл; S2 — площадь поля зрения микроскопа, мкм2; c — навеска почвы, г.
При расчетах бактерий по обычной методике сухой вес бактериальной клетки объема 0.1 мкм3
принимали равной 2 х 10 14 г (Кожевин и др., 1979).
При определении размеров бактерий использовался метод "каскадной" фильтрации, фильтровали почвенную суспензию через фильтры с диаметром пор 1.85, 0.43, 0.38 и 0.23 мкм и мембранные фильтры "Сынпор" с диаметром пор 0.17 мкм. Фильтрацию проводили с помощью колбы Бунзена. Собственную люминесценцию фильтров гасили окрашиванием насыщенным спиртовым раствором Судана черного (Германия). Ядерные фильтры помещали в этот раствор на сутки, мембранные фильтры — на 0.5 ч, затем их промывали в стерильной воде и подсушивали и использовали для фильтрования (Hobbie et al., 1977).
На поверхность сеточки металлического фильтра колбы Бунзена помещали четыре слоя фильтровальной бумаги, сверху фильтр (ядерный или мембранный), который прижимали к поверхности прибора с помощью металлического кольца, и добавляли фильтруемую суспензию. Фильтрование суспензии проводили последовательно от фильтра с большим размером пор к меньшему. Фильтр с размером пор 1.85 мкм использовали исключительно для удаления крупных частиц почвы из суспензии. На каждом фильтре (использовали три повторных фильтра) подсчитывали число бактерий и вычисляли их биомассу, условно принимая размеры клеток равными или чуть большими (>) диаметру пор фильтра, на котором они осаждались. Средний вес клетки определяли, исходя из суммы биомасс клеток с разным диаметром, деля ее на численность этих бактерий. В расчетах принимали, что клетки имеют шаровидную форму.
Аналогичной каскадной фильтрации были подвергнуты суспензии клеток бактерий чистых культур, относящихся к разным таксономическим видам: Arthrobacter luteus 82, Aquaspirillum dispar 38, Bacillus subtilis 43, Bacillus cereus 47, Rodo-coccus erythropolis 17, Cytophaga hutchinsonii 9. Культуры выращивали на качалке на жидкой глюкозо-пептонно-дрожжевой среде (Методы ... , 1991). Использовали клетки 3-суточных и 2-недельных суспензий, которые после удаления культураль-ной жидкости трижды промывали водой с последующим центрифугированием.
Жизнеспособность клеток диаметром 0.17 мкм определяли по их увеличению численности (при их подращивании в термостате при температуре 28°С и в холодильнике при 4°С) в почвенной суспензии без внесения питательных субстратов.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ STATGRAPHICS и STATISTICA. Среднее квадратическое отклонение (д„ _ 1) для значений численности бактерий в образце не превышало 5—10%.
млрд. кл./г 3 г
0
млрд. кл./г 5
4
3 2 1
0
ПОЛЯНСКАЯ и др. (а)
(б)
>0.43 >0.38 >0.28 >0.17
мкм
£
Исх.
Рис. 1. Распределение численности бактерий по фильтрам с разным размером пор. Е — суммарная численность по всем фильтрам, Исх. — численность, определенная традиционным методом. а — типичный чернозем, б — луговая почва, для рис. 1.
2
1
%
40 20
(а)
(б)
> 0.43 > 0.38 > 0.23 > 0.17
мкм
К&К?
уМ:.УМ:.Ч|_|__|_[чу':.У>':.ч|_[_
> 0.43 > 0.38 > 0.23 > 0.17
мкм
0
Рис. 2. Распределение численности бактерий по фильтрам с разными размерами пор (% от общей численности).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Численность бактерий, полученная по принятому методу подсчета на стеклах, в черноземе составляла 1.5 млрд. клеток, а в горно-луговой почве около 2 млрд. клеток на г почвы.
Из почвенной суспензии 1 : 1000 брали 2 мл (доводя стерильной водой до объема 10 мл) и фильтровали последовательно через фильтры с разным диаметром пор.
На рис. 1 представлены данные по численности клеток на фильтрах с разными размерами пор. Численность бактерий во взятой аликвоте (2 мл) почвенной суспензии чернозема была максимальной на фильтрах с диаметром пор 0.23—0.43 мкм — более
3 млрд. кл./г почвы, н
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.