ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 1, с. 43-52
=ЗООЛОГИЯ
УДК 576.895.132
РАЗНООБРАЗИЕ ГАПЛОТИПОВ ITS рДНК У НЕМАТОД Haemonchus contortus (Trichostrongyloidea, Rhabditida) ОТ ОДНОГО ХОЗЯИНА © 2013 г. А. П. Аксенов, С. Э. Спиридонов
Центр паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119049 Москва, ул. Мытная, 28, корп. 1 E-mail: akcenov@yandex.ru Поступила в редакцию 26.09.2011 г.
На материале, собранном в Центральной Монголии, проведено изучение внутривидового полиморфизма нуклеотидных последовательностей участка внутренних транскрибируемых спейсеров (1Т8-1 + 5.88 + ГТ8-2) рибосомальной ДНК у паразитических нематод Наетопскш соМоНиъ. Выявлено значительное разнообразие гаплотипов, различающихся по нуклеотидному составу этого участка ДНК. Проанализированы филогенетические связи между гаплотипами, выявленными в Центральной Монголии, и последовательностями этих нематод из других участков ее ареала (депонированными в N061 ОепВапк). Наряду с гаплотипами, ранее уже отмеченными для Н. соШоНт или отличающимися на 1—2 нуклеотида, выявлены и существенно отличающиеся последовательности.
DOI: 10.7868/S0002332913010037
Нематоды довольно однообразны морфологически, что делает особо важной задачей разработку молекулярных методов их определения. В практическом отношении точность определения видов и внутривидовых группировок особенно важна для нематод, паразитирующих у человека, домашних животных и растений, поскольку разные таксономические группы демонстрируют различные комбинации экономически важных признаков, таких как патогенность и устойчивость к химическим средствам их подавления. Среди проблем молекулярной таксономии паразитических нематод было выделено несколько ключевых (Anderson et al., 1995): вариабельность доменов ДНК, используемых в качестве маркеров на уровне вида, популяции и даже одной особи; генетическая идентичность морфологически различающихся форм и наличие в пределах морфологически гомогенной выборки паразитов-представителей независимых видов, существенно различающихся в генетическом отношении.
Нематода Haemonchus contortus (Rudolphi, 1803) паразитирует в различных домашних и диких жвачных и вызывает существенные потери в животноводстве (Шумакович, 1968). Кроме того, H. contortus является возбудителем гельминтозо-оноза, т.е. способен паразитировать как у животных, так и у человека. Этот вид исследуется молекулярными методами уже более 15 лет (Zarlenga etal., 1994), и к настоящему времени накоплен значительный материал, указывающий на удивительную генетическую пластичность этого вида. В пределах одной популяции этих нематод выяв-
ляются различные гаплотипы рибосомальной ДНК (рДНК) (Garretson et al., 2009). Значительная изменчивость данного вида касается не только рибосомальных генов, с их многочисленными повторами в пределах генома, но и структурных генов. Также было показано, что интроны двух вариантов гена р-тубулина оказались поразительно вариабельны (Beech et al., 1994). Показатель нуклеотидной изменчивости п у них составляет 0.09—0.094, что в несколько раз выше этого показателя у большинства изученных животных и более чем на порядок выше уровня изменчивости этих интронов у Ascaris. Одним из объяснений такой невероятной изменчивости предлагается исключительно высокое значение эффективного размера популяции (effective size) у трихостронги-лид (Constantine, 2002).
Изучение H. contortus в ранее не исследованных регионах мира может дать дополнительные сведения к общей картине генетической изменчивости этого опасного паразита домашних и диких животных. Сам этот вид постепенно становится важным модельным объектом в изучении популяционной структуры у паразитических нематод. Нами было предпринято изучение рибосомальных последовательностей H. contortus, обнаруженных при вскрытии козы в Монголии. Цель исследования — изучение полиморфизма участка внутренних транскрибируемых спейсеров (Internal Transcribed Spacers — ITS) рДНК у этих нематод и выявление в пределах данного вида гаплоти-пов, различающихся по этому домену ДНК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материал для исследования был собран в ходе работ Российско-Монгольской научной экспедиции в Архангайском аймаге Центральной Монголии 11 сентября 2009 г. (Кузнецов и др., 2010а, б).
Нематоды были извлечены из сычуга и использованы для приготовления тотальных препаратов с применением 30%-ного глицерина. Таксономическую принадлежность нематод определяли по особенностям строения половой системы с использованием данных, представленных в литературе (Ивашкин и др., 1971). Первоначальное выделение ДНК из нематоды H. contortus производилось из группы нематод с помощью набора фирмы "Promega" (Wizard® SV Genomic DNA Purification System, США) по протоколу производителя. В дальнейшем, при обнаружении высокого уровня вариабельности, производилось выделение ДНК из индивидуальных особей с использованием протеиназы К по Холтерману с соавт. (Holterman et al., 2006). Однако по этой же самой причине прямое секвенирование полученного продукта было невозможно, и был применен метод векторного клонирования.
Для лигации в пробирку на 0.5 мл вносили 1 мкл двукратного лигационного буфера, 1 мкл pGEM-T вектора, 1 мкл ДНК лигазы, 0.5 мкл продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР) и
1 мкл стерильной воды (реагенты из коммерческого набора фирмы "Promega"). Смесь инкубировали при 4°С в течение 8 ч, после чего проводили трансформацию. Для этого пробирки с продуктом лигации центрифугировали, и по 2 мкл продукта переносили в стерильные пробирки на 1.5 мл. Пробирку с замороженными при —70°С компетентными клетками JM 109 (Escherichia coli) помещали на лед на 20 мин. После этого небольшое число оттаявших клеток (12—20 мкл) добавляли в каждую пробирку с 2 мкл продукта лигации. Эту смесь помещали на лед на 20 мин, после чего на 45—50 с помещали в водяную баню при температуре 42°С. Охлаждали на льду в течение
2 мин, после чего добавляли 950 мкл среды Лу-рия—Бертани, инкубировали при температуре 37°С 1 ч 30 мин. После инкубации пробирки с растущими компетентными клетками JM 109 центрифугировали (2000 об./мин, 5000 g). Надо-садочную жидкость сливали, оставляя на дне пробирки 70—100 мкл клеток в жидкой среде, которые распределяли шпателем по поверхности ага-ризованной среды, приготовленной на основе бульона Лурия—Бертани. Чашки Петри с трансформированными клетками инкубировали при температуре 37°С. Визуализация клонирования проводилась по цвету колоний бактерий: отбирали белые (не голубые) колонии с трансформантами. Небольшое количество бактериальных клеток вносили в пробирки с готовой ПЦР-смесью.
В работе были использованы 5 клонов, полученных из гомогената нескольких особей (клоны с 1-го по 5-й) и 7 клонов, полученных от отдельных особей (клоны с 6-го по 12-й).
Последовательность ITS-участка рДНК (ITS1 + + 5.8S + ITS2) для изученных нематод получали с использованием праймеров AB 28 (5'-ATA-TGC-TTA-AGT-TCA-GCG-GGT-3') и TW 81 (5'-GTT-TCC-GTA-GGT-GAA-CCT-GC-3'). ПЦР проводили по следующей схеме: первичная денатурация ДНК при 94°С в течение 3 мин, после чего 9 циклов, состоящих из денатурации при 94°С 1 мин; отжига (annealing) при 55°С 1 мин 30 с и элонгации цепи при 72°С 1 мин 30 с. После этого следующие 24 цикла, состоящие из денатурации при 94°С 45 с, отжига при 57°С 1 мин и элонгации цепи при 72°С 1 мин 20 с. Реакция завершалась финальной элонгацией при 72°С в течение 5 мин. Очистку ДНК проводили с помощью набора фирмы "Promega" по протоколу фирмы-производителя. После это образцы ДНК переосаждали этанолом в присутствии ацетата аммония и отправляли для секвенирования в ЦКП "Геном" (Россия, Москва).
Выравнивания нуклеотидных последовательностей получали в программе Clustal X (Thompson et al., 1997). Анализ выравниваний проводили при различных алгоритмах анализа в программе PAUP 4.0b10 (Swofford, 2002). Филогенетические деревья рассматривали с помощью программы TreeView 1.6.6 (Page, 1996).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Попытка прямого секвенирования продукта ПЦР с использованием гомогената нескольких особей H. contortus из одного хозяина дала в результате нечитаемые хроматограммы с наложением нескольких пиков почти по каждой из позиций. Было сделано предположение, что причиной неудачи является полиморфизм по данному участку ДНК. После этого было проведено клонирование полученных ПЦР-продуктов, с прочтением нуклеотидных последовательностей от каждого из клонов. Были получены читаемые хроматограммы для 5 клонов из первого гомоге-ната. Все эти 5 клонов имели различные последовательности ITS-участка, отличаясь друг от друга на 2—11 пар оснований, что составляет порядка 0.3—1.4% от общего числа сравниваемых пар оснований.
Обнаруженный высокий уровень полиморфизма в выборке особей H. contortus, использованных для получения данного гомогената, побудил нас исследовать полиморфизм на уровне одной особи этих нематод. С этой целью был подготовлен гомогенат одного образца этих нематод, а полученные ПЦР-продукты клонированы.
Таблица 1. Сиквенсы различных гаплотипов нематоды Haemonchus contortus, задепонированные в NCBI GenBank
H. contortus, клон Сиквенс
4 JN 590053
1 JN 590054
10 JN 590055
7 JN 590056
8 JN 590057
9 JN 590058
11 JN 590059
Для 7 клонов были получены нуклеотидные последовательности ITS-участка. Сравнение полученных последовательностей с таковыми, полученными из первого гомогената, показало, что большая часть клонов, полученных от единственной особи, не была выявлена ранее при изучении гомогената от нескольких особей, хотя отличие
между некоторыми из этих последовательностей составляло лишь несколько оснований. Полученные последовательности были депонированы в NCBI GenBank (табл. 1). Эти данные также были использованы для поиска аналогичных последовательностей в NCBI GenBank. С использованием опции BLAST (Altschul et al., 1990) были выявлены многочисленные сходные последовательности (табл. 2), депонированные для H. contortus различными авторами, которые были использованы для построения единого выравнивания. На основе этого выравнивания методом максимально
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.