МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 83, № 2, с. 236-244
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.26+582.28
РАЗНООБРАЗИЕ ГРИБОВ ДЕЯТЕЛЬНОГО СЛОЯ АНТАРКТИДЫ © 2014 г. Г. А. Кочкина*, 1, С. М. Озерская*, Н. Е. Иванушкина*, Н. И. Чигинева*,
О. В. Василенко*, Е. В. Спирина**, Д. А. Гиличинский**
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино **Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук, Пущино
Поступила в редакцию 18.07.2013 г.
Изучено таксономическое разнообразие грибов в образцах деятельного слоя Антарктиды с использованием традиционных микробиологических методов и метагеномного анализа суммарной ДНК природных образцов. Расширен перечень микроскопических грибов Антарктиды, в т.ч., за счет обнаружения видов, представляющих некультивируемую или стерильную на традиционных питательных средах часть грибного комплекса.
Ключевые слова: мицелиальные грибы, Антарктида, деятельный слой, биоразнообразие, 1Т$2, мета-геномный анализ.
DOI: 10.7868/S002636561402013X
Проблема сохранения жизни при отрицательных температурах во льдах и мерзлых породах имеет фундаментальное значение. Исследования последних лет свидетельствует о том, что толщи многолетнемерзлых отложений являются природным криохранилищем мицелиальных грибов. Жизнеспособные микроскопические грибы Антарктиды выявлены как на ее поверхности [1—3], так и в глубинных многолетнемерзлых отложениях [4—6]. Показано, что распределение грибов в поверхностных горизонтах в значительной степени связано с нахождением "хозяев", какими для антарктических грибов являются, в основном, птицы, насекомые, беспозвоночные, нематоды и растения — мхи и лишайники [7]. Следствием интенсивно проводимых исследований стало увеличение в 10 раз списка родов грибов, найденных в Антарктиде за последние 15 лет — от 40 [8] до почти 400 (база данных "British Antarctic Survey" http://www.antarctica.ac.Uk//bas_research/data/ access/fungi/). Даже с учетом наличия в приведенной базе таксономических синонимов, что значительно увеличивает список наименований, это свидетельствует об огромном интересе микробиологов к данному региону, что продиктовано, в частности, не только желанием обнаружить редкие или новые микроорганизмы и найти новые метаболиты [9], но и получить информацию об общем запасе и биоразнообразии микроорганизмов в антарктических отложениях.
1 Автор для корреспонденции (e-mail: gak@dol.ru).
Для выявления антарктических микроорганизмов большей частью используют традиционные микробиологические методы. Однако есть работы, где параллельно с культуральными исследованиями проводился метагеномный анализ образцов, в основном, с акцентом на разнообразие прокариот [10, 11]. Комплекс методов для изучения мицелиальных грибов используется не так часто [12].
Следует отметить, что характерной особенностью всех этих исследований является то, что обе группы методов дают разные, часто не перекрывающиеся результаты [13]. Например, было обнаружено, что грибы высших таксонов при метаге-номном анализе обычно представлены большим, чем при использовании традиционных микробиологических методов, количеством видов. При этом результаты по разнообразию анаморфных грибов занижены, в частности, за счет микроми-цетов с мелкими спорами. Так, изучение много-летнемерзлых антарктических отложений показало отсутствие при анализе суммарной геномной ДНК грибов таких родов как РетеШшт, Оа^зро-гшт и других, постоянно встречающихся при анализе образцов традиционными микробиологическими методами [14].
Природные особенности деятельного слоя Антарктиды определяют крайнюю неравномерность, микроочаговость распределения численности и видового разнообразия микроорганизмов. В связи с этим можно ожидать, что миколо-
гические исследования образцов, отобранных из пространственно удаленных мест Антарктиды, проведенные с использованием комплекса методов, могут дать новую, более полную информацию о микобиоте данного местообитания.
В настоящей работе представлены результаты изучения разнообразия грибов в образцах активного слоя антарктических отложений, отобранных в разных, далеко отстоящих друг от друга точках континента, с использованием как традиционных микробиологических, так и молекулярных методов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изучено 6 образцов деятельного слоя, отобранных Российской Антарктической Экспедицией в рамках проекта Международного Полярного Года "Возраст вечной мерзлоты Антарктиды" в 2007—2009 гг. в свободных ото льда оазисах, расположенных по периметру материка. Исследованные образцы были отобраны из керна 4-х скважин, расположенных на станциях "Новолазаревская" (Оазис Ширмахера), "Дружная" (бухта Санне-фьорд), "Ленинградская" (Холмы Уилсона) и обсерватории "Мирный" (Берег Отса). Все образцы отобраны из поверхностных и подповерхностных горизонтов (табл. 1).
Для наиболее полного выявления разнообразия культивируемых мицелиальных грибов были использованы разработанные ранее методы размораживания образцов многолетнемерзлых отложений [4]. Мерзлые образцы размораживали в воде, прогретой до 20, 37 и 52°C в течение 1 минуты на водяной бане.
Для культивирования грибов использовали синтетическую стандартную среду Чапека с 2% сахарозы (Cz) и органическую среду Мальц-агар (МЕА) с добавлением молочной кислоты (0.4% по объему) для подавления роста бактерий. Чашки Петри инкубировали при 4 и 25°C в течение месяца. Количество КОЕ определяли в 1 г воздушно-сухой навески, для чего измеряли влажность образцов весовым способом. Параллельно использовали накопительный метод, при этом навески образцов заливали жидкой питательной средой (сусло 3.5 Б) и инкубировали при температуре 4°C в течение 30—60 сут с периодическим визуальным наблюдением.
Идентификацию культур осуществляли на основании культурально-морфологических признаков, изученных при посеве на рекомендуемые среды в соответствии с требованиями современных определителей [15, 16 и др.]. Для идентификации культур подрода Pénicillium использовали современную схему определения, основанную на
анализе макро- и микроморфологических признаков грибов, выявляемых при комбинации различных питательных сред и температур культивирования [17].
Суммарную геномную ДНК экстрагировали из 2-х образцов деятельного слоя Антарктиды, отобранных на станции "Новолазаревская" (табл. 1, №№ 3 и 4). Выделение ДНК проводили с использованием набора реактивов UltraClean Soil DNA Isolation Kit ("Mo Bio Laboratories, Inc.", Carlsbad, CA, США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями производителя. Для максимального выхода ДНК из исследуемых образцов с целью большей десорбции клеток с поверхности почвенных частиц их предварительно обрабатывали ультразвуком.
Метагеномный анализ с акцентом на биоразнообразие микобиоты проводили по следующей схеме: регион второго внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомной ДНК (ITS2) с примыкающими частями генов 5.8S и 28S-субъединиц амплифицировали с консервативными грибоспецифическими праймерами ITS3 (5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3') и ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') [18]. Гетерогенный ампликон разделяли молекулярным клонированием в клетках E. coli, отбирали бактерии, несущие нужную вставку, тестировали вставку вновь ПЦР-амплификацией с "универсальными" праймерами. Полученные ампликоны напрямую секвенировали при помощи автоматического капиллярного прибора, работающего на платформе Сэнгера.
Состав ПЦР-реакции: трис-HCl 50 мМ, pH 9.0; KCl 50 мМ; MgCl2 1.5 мМ; Triton X-100 0.1%; глицерин 10%; cresol red (Na) 0.05 мМ; смесь нуклеотидов по 0.2 мМ каждого ("Prome-ga"); праймеры — по 0.05 мкМ каждого ("Syntol"); TAQ-pol c ингибирующими моноклональными антителами 25 ед./мл ("Syntol"). Типичный объем реакционной смеси 20 мкл, из которого до 20% составляет объем раствора матричной ДНК. Программа ПЦР: первичное плавление матрицы — 7 мин при 95°С; затем 35 циклов 95°C 30 с (плавление), 54°C 45 с (отжиг праймеров), 72°C 60 с (элонгация); 72°C 10 мин (финальная элонгация). Использовали амплификатор MyCycler Thermal Cycler 580BR 2261 ("BioRad"). Продукты реакции разделяли электрофоретически в 2% ага-розном геле, окрашивали бромистым этидием, затем визуализировали и документировали в УФ-трансиллюминаторе с цифровой камерой Gel Doc XR 170-8170 ("BioRad").
Молекулярное клонирование библиотеки ам-пликонов, основанное на методе бело-голубой селекции, проводили лигированием в вектор типа
Таблица 1. Мицелиальные грибы в образцах деятельного слоя Антарктиды
№ образца Местоположение Скважина Географические координаты Глубина (см) Максимальная численность (КОЕ/г) Таксоны
1 Станция "Дружная" LA55-Dr-02 69°44'58.2" ю.ш., 73°42'25.0" в.д. 1-9 0 Penicillium brevicompactum Dierckx*
2 0-0.5 13824.3 Coprinellus micaceus (Bull.) Vilgalys, Hopple et Jacq. Johnson**, Geomyces pannorum (Link) Sigler et J.W. Car-mich., Phoma herbarum Cooke
3 Станция "Новолазаревская" FDG-09-03 70°45'45.3" ю.ш., 11°46'50.2" в.д. 0.5-2 2453.9 Geomyces pannorum (Link) Sigler et J.W. Car-mich., Penicillium chrysogenum Thom., P. crustosum Thom., Phoma herbarum Cooke
4 2-6 1259.1 Epicoccum nigrum Link**, Penicillium aurantiogrise-um Dierckx, P. coprophi-lum (Berk. et M.A. Curtis) Seifert et Samson, P. crustosum Thom., P. griseoful-vum Dierckx, Phoma herbarum Cooke, Pseudeurotium sp.**
5 Обсерватория "Мирный" LA55 Mr-01 66°33'11.4" ю.ш., 93°00'29.5" в.д. 0-1 235.6 Geomyces pannorum (Link) Sigler et J.W. Car-mich., Leuconeurospora sp.**, Phoma herbarum Cooke**, Thelebolus mi-crosporus (Berk. et Broome) Kimbr.**
6 Станция "Ленинградская" LA55 Ln-01 69°30'6.3" ю.ш., 159°23'29.5 " в.д. 0-1.5 7.4 Acremonium strictum W. Gams, Geomyces pan-norum (Link) Sigler et J.W. Carmich., Leuconeurospora sp.**
* Обнаружен с использованием накопительного метода. ** Штаммы идентифицированы с помощью молекулярно-генетического метода.
pGEM® ("Promega pGEM®-T Vector System") с использованием компетентных клеток штамма JM109 E. coli ("Promega") согласно инструкции производителя. Для верификации наличия нужной нуклеотидной вставки и наработки фрагмента для секв
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.