ГЕНЕТИКА, 2015, том 51, № 7, с. 841-846
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 579.222:577.152.199.2
РАЗНООБРАЗИЕ КЛЮЧЕВЫХ ГЕНОВ ДЕСТРУКЦИИ БИФЕНИЛА В МИКРОБНОМ СООБЩЕСТВЕ ПРИБРЕЖНЫХ ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ АНАДЫРСКОГО ЗАЛИВА
© 2015 г. Е. С. Шумкова1' 3, А. О. Воронина1, 2, Н. В. Кузнецова1, 2, Е. Г. Плотникова1, 2
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук, Пермь 614081
e-mail: ekaterinash80@mail.ru 2Пермский государственный национальный исследовательский университет, кафедра ботаники и генетики растений, Пермь 614990 3Институт молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991
e-mail: peg@iegm.ru Поступила в редакцию 29.08.2014 г.
Бифенил 2,3-диоксигеназа — ключевой фермент в бактериальной деструкции бифенила и поли-хлорированных бифенилов (ПХБ), являющихся высокотоксичными устойчивыми соединениями. Исследовано разнообразие bphA1-генов, кодирущих а-субъединицу бифенил 2,3-диоксигеназы, бактерий-деструкторов бифенила, входящих в состав микробного сообщества донных отложений прибрежной части Берингова моря (район порта Анадырь). Из накопительной культуры, полученной в результате инкубации образцов донных отложений с бифенилом, была выделена тотальная ДНК для дальнейшего ПЦР-анализа с использованием вырожденных праймеров, комплементарных бактериальным генам а-субъединиц бифенил 2,3-диоксигеназ. Методом клонирования ПЦР-продукта выявлены три типа генов ароматических диоксигеназ, филогенетически близких генам подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ и 3-фенилпропионат диоксигеназ бактерий порядка Actinomycetales.
DOI: 10.7868/S0016675815070127
Проблема очистки наземных и водных экосистем, загрязненных токсичными, устойчивыми к разложению химическими соединениями, занимает центральное место в ряду актуальных задач современной экологии. Загрязнение хлорированными углеводородами стоит на втором месте после нефтяного загрязнения по степени опасности для морских экосистем [1]. Полихлорированные бифенилы (ПХБ) относятся к группе стойких органических загрязнителей (СОЗ), производство и использование которых в настоящее время запрещено Стокгольмской конвенцией [2]. Однако широкое применение ПХБ в течение нескольких десятилетий привело к существенному ухудшению экологической обстановки в России [3].
В настоящее время ПХБ обнаруживаются повсеместно, в том числе на территориях, находящихся на значительном удалении от мест их производства и использования. ПХБ переносятся воздушными потоками в Арктику из средних широт и интенсивно накапливаются в объектах окружающей среды. Низкие температуры воздуха и поверхности земли в Арктике, снежный покров и отсутствие света продолжительной зимой резко замедляют интенсивность биологической (микробной) деградации и ассимиляции, способствуя
накоплению ПХБ в воде, почве, донных отложениях. Поэтому мониторинг загрязнения арктических морских экосистем имеет важное значение.
Мониторинг СОЗ (ПХБ) в атмосферном воздухе Чукотского АО показал, что распределение конгенеров ПХБ в воздухе практически соответствует составу совола — технической смеси ПХБ, широко применявшейся на территории бывшего СССР, что свидетельствует о возможном наличии локальных или региональных источников загрязнения ПХБ в районе места пробоотбора (метеостанция Валькаркай в 40 км к северу от г. Певека) на Чукотке. Также следует отметить, что уровни содержания ПХБ в воздухе на Чукотке относятся к наиболее высоким среди данных по всем станциям мониторинга СОЗ глобальной Арктики [4, 5].
В настоящее время интенсивно развиваются методы ремедиации природной среды с использованием бактерий-деструкторов и выделенных из них ферментов. Методы биоремедиации имеют неоспоримые преимущества перед физическими и химическими методами деструкции хлорорганики благодаря своей эффективности и безопасности [6].
Таким образом, интерес представляет исследование сообществ микроорганизмов, способных в
условиях низких температур осуществлять деструкцию бифенила/ПХБ. Кроме того, мониторинг ключевых генов (bph), ответственных за разложение этих токсикантов, может дать представление о биодегра-дационном потенциале микробного сообщества донных отложений (порт Анадырь, Чукотка).
В Арктических морях с разным уровнем загрязнения ПХБ проводились исследования распространения, численности ПХБ-трансформирующих бактерий (ПХБ-ТРБ), а также ПХБ-толерантных и сапротрофных бактерий. Установлено, что в Анадырском заливе Берингова моря широко распространены ПХБ-трансформирующие/толерантные бактерии и наибольшая численность ПХБ-ТРБ выявлена в придонном слое [7].
Известно, что деструкция бифенила и ПХБ у аэробных бактерий осуществляется по одному биохимическому пути. На первом этапе разложения бифенил окисляется до бифенил-дигидро-диола бифенил 2,3-диоксигеназой. а-Субъеди-ница бифенил 2,3-диоксигеназы (bphAl) отвечает за распознавание субстрата и связывание с ним, поэтому ген bphAl является важным маркером при исследовании биодеградационного потенциала бактериального сообщества [8].
Цель данной работы — оценка разнообразия bphAl-генов в микробном сообществе донных отложений прибрежной части Берингова моря (район порта г. Анадырь).
Образцы донных отложений были отобраны летом 2008 г. на паромной переправе через Анадырский лиман в черте г. Анадырь (полоса прибоя). Ассоциация микроорганизмов из образцов донных отложений была получена методом накопительного культивирования отобранных образцов в течение 3 месяцев в минеральной среде следующего состава (г/л): NaCl — 20.0, MgCl2 — 3.0, MgSO4 - 2.0, KCl - 1.0, CaCl2 - 0.5, FeSO4 - 1.0, (NH4)2SO4 - 1.0, при 18-20°С. В качестве единственного источника углерода и энергии в среду добавляли бифенил (1 г/л).
Выделение ДНК из полученной накопительной культуры проводили с использованием набора реактивов для выделения геномной ДНК из бактериальных клеток ("Биосилика", Россия). ПЦР осуществляли на приборе MyCycler ("BioRad Laboratories", США). Для амплификации bphAl-генов использовались вырожденные прай-меры, предложенные Iwai et al. [9], специфичные к гену а-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназы.
ПЦР-фрагменты bphAl-генов клонировали в клетках Е. coli BMH в составе вектора pGEM-T Easy ("Promega", США). Трансформацию компетентных клеток Е. coli BMH проводили при использовании электропоратора ("Bio-Rad Laboratories", США). Отбор рекомбинантных клонов
осуществляли на основании "бело-голубого" теста, высевая трасформанты на среду LB, содержащую 25 мкг/мл ампициллина, l мМ IPTG, 50 мкг/мл X-gal ("Fermentas", Литва). С ДНК-матрицы отобранных рекомбинантных клонов проводили амплификацию фрагментов bphAl-генов со специфичными праймерами BPHD-Í3 и BPHD-rl [9]. ПДРФ-анализ полученных ампликонов осуществляли с использованием эндонуклеаз Hhal и HaelII ("Fermentas", Литва) согласно инструкции производителя.
Для секвенирования фрагментов bphAl-генов, клонированных в составе вектора pGEM-T Easy, проводили амплификацию вставки с использованием универсальных праймеров Ml3 (прямого 5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3' и обратного 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'), для которых имеются сайты связывания в векторе pGEM-T Easy по обеим сторонам от полилинкера. Определение нуклеотидных последовательностей bphAl-генов проводили с применением набора реактивов Big Dye Terminator Ready Reaction Kit v. 3.l ("Applied Biosystems", США) на автоматическом секвенаторе Genetic Analyser 3500XL ("Applied Biosystems", США) согласно рекомендациям производителя. Секвенирование осуществляли с прямого праймера Ml3.
Поиск гомологов bphAl-генов по международным базам данных GenBank и их анализ осуществляли с помощью алгоритма BLAST (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov). Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием программы ClustulX (http:// www.ebi.ac.uk). Для построения дерева сходства использовали алгоритм UPGMA, реализованный в пакете программ CLC Sequence Viewer 6 (http://www.clcbio.com/products/clc-sequence-view-er). Оценку статистической достоверности ветвления ("bootstrap-анализ") проводили на основе l000 альтернативных деревьев. Для визуализации дерева использовали программу FigTree v. l.3.l (tree.bio.ed.ac.uk).
С препарата ДНК, выделенного из накопительной культуры, с помощью праймеров BPHD-Í3 и BPHD-rl [9] был получен ПЦР-продукт ожидаемой длины (~500 пн). В результате клонирования полученного ПЦР-продукта создана библиотека bphAl-генов бактерий-деструкторов, входящих в состав микробного сообщества донных отложений прибрежной зоны порта Анадырь. Для анализа было отобрано 64 рекомбинантных клона. Методом ПЦР с использованием праймеров к гену bphAl [9] показано, что все они содержали клонированный фрагмент ДНК размером ~500 пн.
ГЕНЕТИКА том 5l № 7 20l5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Рис. 1. Электрофореграмма рестрикционных фрагментов ЬркА1-генов после обработки эндонуклеазаой Hhal. 1, 16 — маркер O'GeneRuler™ 100 bp Plus DNA Ladder ("Fermentas", Литва); 3, 4, 6, 8, 10, 13, 14, 15 — рекомбинантные клоны (геномогруппа I); 2, 5, 9, 12 — рекомбинантные клоны (геномогруппа II); 7, 11 — рекомбинантные клоны (геномогруп-па III).
ПДРФ-анализ с использованием эндонукле-азы Ика1 позволил выявить три типа амплифици-рованных нуклеотидных последовательностей. На рис. 1 приведены картины рестрикции амплико-нов произвольно выбранных 14 (из исследованных 64) рекомбинантных клонов. Дополнительный ре-стрикционный анализ амплифицированных фраг-
ментов с использованием эндонуклеазы Нае111 свидетельствовал в пользу предположения о сходстве генов внутри каждой группы (данные не представлены).
Были определены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов ДНК из каждой выявленной геномогруппы и проведен фи-
Анализ клонированных нуклеотидных последовательностей
Геномогруппа (клон) Наиболее близкие гомологичные гены [номер GenBank] Перекрывание*, % Сходство**, %
I (клон 9b) Rhodococcus equi 103S, ген гипотетической диоксигеназы, гидроксилирующей ароматическое кольцо [FN563149.1] 99 81
Mycobacterium massiliense str. GO 06, ген а-субъединицы 3-фенилпропионат/циннамат диок
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.