МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 2, с. 165-174
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.26+579.222+579.226+575.8
РАЗНООБРАЗИЕ КУПРОПРОТЕИНОВ И СИСТЕМ ГОМЕОСТАЗА МЕДИ У МЕЫОШБЛСТЕЯ ЮБЕШ - ФАКУЛЬТАТИВНО АНАЭРОБНОГО ТЕРМОФИЛЬНОГО ПРЕДСТАВИТЕЛЯ НОВОГО ФИЛУМА ЮМЛПБЛСТЕЯЛЕ
© 2015 г. О. В. Карначук1, *, С. Н. Гаврилов**, М. Р. Авакян*, О. А. Подосокорская**, Ю. А. Франк*, Е. А. Бонч-Осмоловская**, И. В. Кубланов1, **
*Кафедра физиологии растений и биотехнологии, Томский государственный университет **Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 14.05.2013 г.
В геноме МеНопЬа^ег гозеиз, одного из двух представителей недавно описанного филума ^пау1Ьае-tепа был проведен поиск генов, кодирующих белки, связанные с транспортом меди и содержащие медь в качестве кофактора, с последующей их характеристикой. В результате геномного анализа у данного факультативно анаэробного организма были выявлены различные медьсодержащие окси-доредуктазы. Было исследовано влияние концентрации ионов Си2+ в культуральной среде на рост М. гозеиз. В результате геномного анализа у данного факультативно анаэробного организма были выявлены различные медьсодержащие оксидоредуктазы. Было детектировано три АТФазы, осуществляющие транспорт меди, одна из которых (МЯ08_1511) с большой вероятностью участвует в сборке медьсодержащей цитохром с-оксидазы, тогда как две других (МЯ0£_0327 и МЯ08_0791) обладают, по-видимому, детоксификационной функцией. Наличие нескольких медьсодержащих ок-сидоредуктаз и систем гомеостаза меди у М. гозеиз соотносится с ранее высказанной гипотезой происхождения филума ^пау1Ьа^епае от общего с Bacteгoidetes и СЫогоЫ аэробного предка.
Ключевые слова: геномные исследования, купропротеины, гомеостаз меди, медные АТФазы, Melioribacter roseus, Ignavibacteriae.
DOI: 10.7868/S0026365615020056
ВВЕДЕНИЕ
Медь, наряду с железом и цинком, является одним из наиболее распространенных металлов, входящих в состав белков прокариотических и эукариотических клеток [1]. Медь в качестве кофактора содержат такие белки прокариот как ци-тохромоксидазы, супероксиддисмутазы, аминок-сидазы, метанмонооксигеназы, прочие медные оксидазы и лакказы. Как показывают геохимические расчеты, в анаэробных условиях основное количество меди недоступно для живых клеток, так как присутствует в виде сульфидов с чрезвычайно низкой растворимостью [2]. Предполагается, что доступная для живых клеток медь в значимых количествах появилась в океане только после его оксигенирования, начавшегося между 3 и 2 млрд лет назад, в связи с чем медь характеризуют как "современный" металл [3]. Анализ полных геномов бактерий и архей, доступных к 2008 г., показал, что большинство анаэробов не исполь-
1 Авторы для корреспонденции (e-mail: olga.karnachuk@green. tsu.ru, kublanov.ilya@gmail.com).
зует Си в качестве кофактора ферментов, в то время как в геномах аэробов гены, кодирующие медьсодержащие белки, представлены достаточно широко [1]. Таким образом, геномные исследования подтвердили высказанную биогеохимиками идею о том, что геохимические сигналы окружающей среды, закодированные в белках, сохраняются в течение геологических масштабов времени, и их использование может помочь определить ход некоторых эволюционных событий у живых организмов [2].
Медь не только входит в состав биологических молекул, но в высоких концентрациях (>1 мг/л) является токсичной для живых клеток. Предполагается, что биохимические механизмы, защищающие клетку от ионов меди, появились эволю-ционно значительно раньше первых купропротеи-нов [3, 4]. Основным механизмом детоксификации меди является выкачивание ее излишков из цитоплазмы медными АТФазами Р-типа [5]. Наряду с АТФазами у грамотрицательных прокариот были обнаружены другие механизмы, задействующие
"RND efflux" транспортеры, транслоцирующие медь преимущественно из периплазматического пространства; секвестирующие медные оксида-зы; образующие полифосфаты полифосфаткина-зы. В отличие от медных АТФаз, RND-транспор-теры выводят наружу ионы меди и других металлов по принципу антипорта. В настоящее время данная группа классифицируется как надсемейство 2.A.6 базы данных TCDB [6], содержащее огромное количество транспортных белков, обнаруженных во всех доменах живых организмов [7]. Внутри этого надсемейства транспортеры меди относятся к семейству HME (heavy metal efflux — эффлюкс-транс-портеры тяжелых металлов 2.A.6.1).
В качестве возможных мест обитания микроорганизмов, где могли появиться различные механизмы детоксификации меди (в том числе основанные на медных АТФазах), рассматривают как оксигенированные водные экосистемы с высокой растворимостью ионов Cu2+, так и морские гидротермы, где вследствие повышенных температур и высокой концентрации тяжелых металлов возможно присутствие значительных количеств растворимых сульфидов меди в анаэробных условиях [1].
Описанная недавно факультативно анаэробная умеренно термофильная бактерия Meliorib-acter roseus [8] представляет собой хорошую модель для оценки взаимосвязи наличия у организма купропротеома (совокупности медьсодержащих белков) c аэробным или анаэробным характером его роста. Melioribacter roseus gen. nov., sp. nov. [8] был охарактеризован как представитель нового семейства Melioribacteraceae внутри нового филума Ignavibacteriae. Последний относится к группе близкородственных филумов, включающей также филумы Chlorobiи Bacteroidetes [8, 9]. Помимо M. roseus, еще одним культивируемым представителем Ignavibacteriae является Ignavibacterium album [10, 11]. Оба организма — M. roseus и I. album — являются факультативными анаэробами и органо-гетеротрофами [8]. На основании геномных и фе-нотипических характеристик представителей Chlorobi, Bacteroidetes и Ignavibacteriae была предложена следующая цепь эволюционных событий: разделение общего аэробного предка на Bacteroidetes и общего предка Ignavibacteriae/Chlo-robi; последовавшее за этим разделение Ignavibacteriae и Chlorobi, связанное с захватом последними новой экологической ниши и принципиальным изменением их метаболизма [8].
M. roseus был выделен из образца микробных обрастаний, развивающихся на изливе геотермальной воды из скважины Р3 (Парабельский район Томской области), вскрывающей подземные водоносные горизонты на глубине не менее 2700 м. Предполагается, что в поверхностный мат M. roseus попал именно из глубинных горизонтов,
которые характеризуются повышенной концентрацией металлов и металлоидов [8]. Таким образом, M. roseus должен обладать набором систем, контролирующих внутриклеточное содержание токсичных металлов, в том числе меди.
Целью настоящего исследования был поиск в геноме M. roseus генов, кодирующих купропроте-ины и системы гомеостаза меди и проверка высказанной ранее гипотезы об изначально аэробном метаболизме Ignavibacteriae.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штамм Melioribacter roseus Р3М-2Т был взят из коллекции культур лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН. Проверку его устойчивости к ионам Cu2+ проводили при выращивании на модифицированной среде Видделя [8] с добавлением меди из стерильного раствора CuCl2 до конечной концентрации 10, 20, 30 или 50 мг/л.
Для поиска генов, кодирующих белки, связанные с гомеостазом меди, использовали полный геном M. roseus Р3М-2Т, депонированный в GenBank NCBI (CP003557.1). Искомые гены определяли по сходству с кодирующими последовательностями, определенными для Bacteria и Archaea Ридж и соавт. [1]. Для RND-транспортеров дополнительно проверяли консервативные последовательности трансмембранной a-спирали IV [7], для медных АТФаз — консервативные домены [12]. Гомологи найденных в геноме M. roseus генов искали с помощью алгоритма BLASTp, используя стандартные параметры [13]. Полученные наборы белков M. roseus и их гомологов использовали для филогенетического анализа, который проводили с применением пакета MEGA5 [14]. Были взяты ближайшие 100 гомологов для каждого белка, таким образом, общий начальный набор последовательностей для филогенетического анализа состоял из 3 АТФаз M. roseus и 297 ближайших родственников. С помощью сервера CD-hit [15] были удалены 100%-но идентичные последовательности (дубликаты), после чего осталось 270 последовательностей; из них 3 неполные последовательности (2 из Firmicutes и 1 из Bacteroidetes) были удалены вручную, таким образом, финальный набор сиквенсов равнялся 267. Для построения дендрограмм использовали метод ближайшего соседа (Neighbor-Joining) и метод максимального правдоподобия (Maximum Likelihood).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Гены, кодирующие купропротеины присутствуют в геноме Melioribacter roseus. В геноме M. roseus было обнаружено несколько генов, кодирующих
Таблица 1. Присутствие купропротеинов в геномах представителей Ignavibacteriae, Chlorobi и Bacteroidetes (по результатам анализа базы данных NCBI)
Ignavibacteriae Chlorobi Bacteroidetes
M. roseus I. album
Ферменты семейства цитохром с-оксидаз + + +
Медьсодержащая редуктаза закиси азота + + - +
Медная оксидоредуктаза, полифенол оксидаза, лакказа + + + +
* За исключением Chlorobaculum parvum.
Таблица 2. Доменная структура и основные консервативные мотивы функциональных доменов медных АТФаз Р-типа у МеНопЬа^ег гозеиз Р3М-2
Номер ОРС АТФазы в геноме N-концевой домен Каталитический цитоплазматический домен
мотивы связывания металлов стабилизирующий мотив мембранный сайт связывания тяжелых металлов мотив фосфори-лирования мотив связывания фосфата мотив "hinge''-региона, связывающего каталитический и С-концевой домены
MROS_0327 MROS_0791 MROS_1511 CASC CSTC... CASC CFHC... CNGC... CSSC TGES TGEP TGES CPC CPC CPC DKTGTIT DKTGTIT DKTGTIT LLTGD MITGD LLTGD VAMVGDGINDAPALAQADLSIAI VAMVGDGINDAPALAQADIGLAI VMMIGDGLNDAGALQKSD
* Жирным шрифтом выделены наиболее консервативные аминокислотные остатки по данным Чан с соавт. [16].
различные медьсодержащие белки, включая ци-тохром с-оксидазы (кислородредуктазы) cbb3 (MROS_1513) и cc(o/b)o3 (MROS_0038), N2O ре-дуктазу (MR0S_1106) и лакказу (MR0S_0146) (табл. 1). Ближайшие гомологи этих купропротеинов бы
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.