БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 6, с. 767 - 774
УДК 541.14
РАЗНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ОДИНАКОВЫХ СИММЕТРИЧНЫХ МУТАЦИЙ ВБЛИЗИ ДИМЕРА БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА В РЕАКЦИОННОМ ЦЕНТРЕ ШоЛ,оЬас1ег 8ркаего1йе8
© 2015 Л.Г. Васильева1*, Т.Ю. Фуфина1, А.Г. Габдулхаков2, В.А. Шувалов1
1 Институт фундаментальных проблем биологии, 142290Пущино Московской обл.; факс: +7(496)733-0532, электронная почта: vsyulya@mail.ru
2 Институт белка, 142290 Пущино Московской обл.; факс: +7(495)514-0218, электронная почта:protres@vega.protres.ru
Поступила в редакцию 03.12.14 После доработки 11.02.15
В бактериальном реакционном центре (РЦ) асимметричное белковое окружение димера бактериохлоро-филла (БХл) в значительной степени определяет фотофизические и фотохимические свойства первичного донора электрона. Ранее нами были замечены существенные различия в свойствах РЦ Rhodobacter sphaeroides с одинаковыми заменами в симметричных позициях — 1(М206)Н и 1(Ь177)Н. Мутация 1(Ь177)Н приводила к появлению ковалентной связи БХл РА с Ь-субъединицей, а также к образованию шестой координационной связи центрального атома М^2+ бактериохлорофилла ВВ с его белковым окружением. В РЦ 1(М206)Н подобных изменений пигмент-белковых взаимодействий обнаружено не было. Кроме того, удельное количество РЦ 1(М206)Н после очистки из мембран было на порядок ниже, чем количество РЦ 1(Ь177)Н. В данной работе показано, что замены аминокислотных остатков в положениях М203—М206 вблизи молекул РВ и ВА на симметричные им остатки Ь-субъединицы из окружения БХл РА и ВВ приводят к дальнейшему снижению количества РЦ в мембранах, связанному, очевидно, с нарушением сборки комплекса. Внесение водородной связи БХл РВ с белком с помощью мутации Б(М197)Н стабилизировало мутант-ные РЦ, однако не повлияло на их низкий выход при очистке. Предполагается, что мутация 1(М206)Н и замены аминокислотных остатков в положениях М203—М205 могли нарушить связывание гликолипида с поверхностью РЦ вблизи мономерного БХл ВА, необходимое для стабильной сборки комплекса в мембране.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: бактериальный фотосинтез, Rhodobacter sphaeroides, фотосинтетический реакционный центр, направленный мутагенез, бактериохлорофилл, координирование магния, пигмент-белковые взаимодействия.
Фотосинтез относится к важнейшим биохимическим процессам, поддерживающим жизнь на Земле. Первые этапы процесса преобразования энергии света в энергию химических связей происходят в фотосинтетических реакционных центрах (РЦ) растений, водорослей и бактерий. РЦ пурпурной несерной бактерии Rhodobacter sphaeroides состоит из трех белковых субъединиц Ь, М и Н и десяти кофакторов, нековалентно связанных с белком. Кофакторы представлены
Принятые сокращения: БХл — бактериохлорофилл; РЦ — реакционный центр; Р — специальная пара бактерио-хлорофиллов; РАи РВ — бактериохлорофиллы специальной пары; ВА и ВВ — мономерные бактериохлорофиллы; ЛДАО — лаурилдиметиламиноксид.
* Адресат для корреспонденции.
четырьмя молекулами бактериохлорофилла (БХл), двумя молекулами бактериофеофитина (БФео), двумя молекулами убихинона, атомом негемового железа и молекулой каротиноида [1]. В структуру РЦ включено значительное количество молекул воды [1—5], часть которых играет важную роль в функционировании комплекса [6, 7]. Кроме того, во многих известных к настоящему времени кристаллографических структурах РЦ Rba. sphaeroides обнаружено от одной до трех молекул липидов, которые, по-видимому, участвуют в прочном связывании кофакторов [4, 8].
Одной из особенностей РЦ является сочетание относительной структурной симметрии и строгой функциональной асимметрии. Несмотря на то, что кофакторы организованы в две псевдосимметричные ветви, А и В, только одна
из них, ветвь А, функционально активна [9]. Известно, что степень гомологии аминокислотных последовательностей Ь- и М-субъединиц, связывающих кофакторы, составляет всего ~30% [2]. Известен ряд работ, направленных на искусственную «симметризацию» РЦ ЯЬа. саряиШш, на повышение гомологии отдельных участков Ь- и М-субъединиц [10, 11]. Долгое время считалось, что именно различие белкового окружения кофакторов в двух ветвях переноса электрона лежит в основе функциональной активности А-ветви и неактивности В-ветви. Согласно последним данным, липиды, связанные с поверхностью комплекса, также могут участвовать в обеспечении структурной и функциональной асимметрии РЦ [4, 8].
В пространственной структуре РЦ ЯЬа. зркаг-го1йез на периплазматической стороне мембраны два БХл, РА и РВ, формируют специальную пару Р, перекрываясь на уровне первых колец тетрапирролов (рис. 1, а). Ближайшее белковое окружение Р отличается высокой консервативностью и низкой степенью гомологии (рис. 1, б). В результате многочисленных исследований последних лет было показано, что окружение димера БХл в значительной степени определяет его фотофизические и фотохимические свойства как первичного донора электрона [9, 12, 13]. Также было показано, что в зависимости от количества водородных связей Р с ближайшими аминокислотными остатками может меняться термостабильность мутантных РЦ [14].
Недавно нами было показано, что одиночное аминокислотное замещение изолейцина на гистидин вблизи димера БХл в двух симметричных позициях — М206 и Ь177 (рис. 1) приводит к сходным спектральным изменениям в РЦ ЯЬа. врка-его1йгз [15—17]. В частности, в обоих случаях в спектре поглощения РЦ наблюдались падение дипольной силы и коротковолновый сдвиг Ру полосы Р, а также отмечалось снижение стабильности РЦ [15—17]. В то же время были замечены существенные различия. Мутация 1(Ь177)Н приводит к появлению ковалентной связи БХл РА с Ь-субъединицей, а также к образованию шестой координационной связи центрального атома М^2+ бактериохлорофилла ВВ с его белковым окружением [5, 17, 18], в то время как в РЦ 1(М206)Н подобных изменений пигмент-белковых взаимодействий обнаружено не было [15]. Следует также отметить, что снижение стабильности РЦ было более выражено в случае РЦ 1(М206)Н, и удельное количество этих РЦ при очистке из мембран было на порядок ниже, чем количество РЦ 1(Ь177)Н.
Целью данной работы было исследование причин различных последствий одинаковых замещений в симметричных позициях вблизи молекулы Р, направленное на понимание природы ковалентной связи БХл с белком в РЦ 1(Ь177)Н. Для повышения сходства белкового окружения БХл РВ и ВА с окружением молекул РА и ВВ были проведены аминокислотные замены в коротком, М203-М206, и более протяженном, М203-М212,
М гликолипид
Рис. 1. а — Участки Ь(167—183) и М(196—212) а-спиралей Ь- и М-субъединиц вблизи бактериохлорофиллов в структуре РЦ ЯЬа. sphaeroides (PDB 1М3Х, [4]). Фитольные «хвосты» бактериохлорофиллов не показаны для улучшения обзора; б — фрагменты аминокислотных последовательностей а-спиралей, показанных на левом рисунке [5]. Гомологичные последовательности выделены, негомологичные — подчеркнуты. Позиции изолейцинов М206 и Ь177, гистидиновых лигандов М202 и Ь173, а также гистидина Ь168 и фенилаланина М197 показаны стрелками
участках трансмембранной а-спирали М-субъ-единицы. Кроме того, было внесено аминокислотное замещение Б(М197)Н, призванное стабилизировать мутантные РЦ за счет образования водородной связи между ацетильной группой БХл РВ и имидазольной группой Ш8-М197.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клетки рекомбинантных штаммов Rba sphae-roides выращивали на культуральной среде Хат-нера в присутствии тетрациклина (1 мкг/мл), ка-намицина (5 мкг/мл) и стрептомицина (5 мкг/мл) как описано ранее [16]. Процедура получения хроматофоров из несодержащих антенн штаммов Rba. sphaeroides и выделения РЦ с помощью метода ионообменной хроматографии описана ранее [16, 17]. Количество РЦ после очистки из мембран оценивали по длинноволновой полосе поглощения мономерных БХл вблизи 800 нм в 1 см кювете (ODV800) в расчете на 1 л трехдневной культуры. Экстракцию пигментов из реакционных центров осуществляли смесью ацетона с метанолом в соотношении 7 : 2 по ранее описанному методу [19]. Спектры поглощения измеряли при комнатной температуре на спектрофотометре Shimadzu UV-1601PC (Япония). Моделирование пространственных структур РЦ проводили с помощью программы PyMol (http:// www.pymol.org).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На рис. 2 представлены спектры поглощения РЦ дикого типа, РЦ 1(М206)Н и РЦ 1(Ь177)Н. В спектрах РЦ 1(М206)Н и 1(Ь177)Н в области переходов наблюдается сходное смещение максимумов полосы поглощения первичного донора электрона Р в коротковолновую область: 870 нм для РЦ дикого типа, 852 нм для РЦ 1(М206)Н и 847 нм для РЦ 1(Ь177)Н (рис. 2). Кроме того, в спектре РЦ 1(М206)Н наблюдается появление дополнительной полосы при 831 нм, природа которой не ясна. Количество РЦ после очистки в расчете на 1 л культуры составило 4—5 ODV8oo для дикого типа, 2—3 ODV для 1(Ь177)Н и 0,1 ODV для 1(М206)Н.
При замене аминокислотных остатков в положениях М203—М206 на остатки из симметричного участка Ь-субъединицы, Ь174-Ь176, изменялись свойства и молекулярный объем белкового окружения БХл РВ (рис. 1, б). Значения парциальных молекулярных объемов аминокислотных остатков при 25° в воде, взяты из работы [20], приведены в скобках и указаны в см3 • моль-1.
В положении М203 остаток Gly (37,5) был заменен на остаток Met (99,6) большего объема. В положении М204 Leu (101,9) был заменен на Ile (99,9). Оба аминокислотных остатка алифатические, сходного объема, но с разной длиной боковых цепей. В положении М205 слабополярный остаток Ser (55,0) был заменен на неполярный Ala (54,7) сходного объема [20].
В спектре поглощения РЦ с двойной заменой G(M203)М+I(M206)H наблюдалось смещение длинноволновой полосы первичного донора электрона (870 нм в РЦ дикого типа) в коротковолновую область до 848 нм и длинноволновый сдвиг Qy полосы поглощения мономерных БХл от 804 до 810 нм. Как и в спектре РЦ 1(М206)Н, отмечалось появление полосы с максимумом при 831 нм (рис. 3, а). Удельное количество РЦ G(M203^+I(M206)H при очистке, как и для РЦ I(M206)H, составило около 0,1 ODV800 на 1 л трехдневной культуры. Аналогичные спектральные изменения наблюдались также в РЦ с двойной мутацией S(M205)A + I(M20
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.