БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2010, том 27, № 2, с. 184-188
УДК 577.23
РАЗОБЩАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ В ПРИСУТСТВИИ СУБСТРАТОВ ADP/АТР-И АСПАРТАТ/ГЛУТАМАТНОГО АНТИПОРТЕРОВ УСИЛИВАЕТСЯ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
© 2010 г. О. В. Кожина, В. Н. Самарцев
Марийский государственный университет, 424001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс: (836-2)56-57-81; электронная почта: samvic56@mail.ru Поступила в редакцию 18.05.2009 г.
Показано, что при окислении сукцината в присутствии ротенона и антиоксиданта тролокса (или пирувата) в митохондриях печени крыс зрелого возраста (9—12 мес) дыхание, стимулированное пальмитатом, подавляется ЛБР (субстратом ЛБР/АТР-антипортера) и аспартатом (субстратом ас-партат/глутаматного антипортера). Однако было обнаружено, что в присутствии окисляющего агента трет-бутилгидропероксида ни ЛБР, ни аспартат не эффективны даже при их совместном действии. В присутствии ЛБР и аспартата разобщающая активность пальмитата минимальна при ингибировании тролоксом или пируватом перекисного окисления липидов и повышается при увеличении скорости аккумуляции диеновых конъюгатов, достигая максимального значения при вызванном трет-бутилгидропероксидом окислительном стрессе. В митохондриях печени крыс старческого возраста (22—26 мес) при высокой интенсивности перекисного окисления липидов ЛБР и аспартат не влияют на разобщающее действие пальмитата (Самарцев и Кожина, 2008). Сравнительные исследования показали, что в митохондриях печени крыс зрелого и старческого возрастов при одинаковой скорости аккумуляции диеновых конъюгатов разобщающая активность пальмитата в присутствии ЛБР и аспартата достигает одной и той же величины относительно максимальной активности. Сделано заключение, что усиление свободно-радикальных реакций и перекисного окисления липидов в митохондриях печени может приводить к увеличению протонофорной разобщающей активности жирных кислот при участии ЛБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров путем подавления способности физиологических субстратов этих переносчиков ЛБР и аспартата ингибировать процесс разобщения.
Ключевые слова: митохондрии, окислительный стресс, жирные кислоты, разобщение окислительного фосфорилирования, ЛБР/АТР антипортер, аспартат/глутаматный антипортер.
Свободные длинноцепочечные жирные кислоты играют важную роль в окислительном метаболизме как природные разобщители окислительного фосфорилирования в митохондриях различных органов и тканей [1, 2]. В отсутствие ионов кальция в инкубационной среде разобщающее действие жирных кислот в митохондриях печени осуществляется по протонофорному механизму, главным образом при участии белков-переносчиков субстратов: ЛЭР/ЛТР- и аспартат/глутаматного антипортеров [1, 3]. Предполагается, что их участие в разобщении заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, в то время как последующий перенос недиссоциированной формы кислоты через фосфолипидный бислой осуществляется по механизму флип-флоп без участия белков [1, 3]. Специфический ингибитор ЛЭР/ЛТР-антипортера карбоксиатрактилат и субстраты аспартат/глутаматного антипортера
аспартат и глутамат эффективно подавляют разобщающее действие жирных кислот, т.е. обладают ресопрягающим действием [1, 3, 4]. Такое разобщающее действие жирных кислот, называемое также "мягким", представляет интерес как один из путей снижения продукции в митохондриях активных форм кислорода [1]. Как показано нами ранее, инкубация митохондрий печени в контролируемом состоянии, т.е. в отсутствие синтеза АТР и разобщителей, при окислении сукцината в присутствии ротенона приводит к накоплению продуктов перекисного окисления липидов диеновых конъюгатов, и этот процесс подавляется одной из наиболее распространенных природных жирных кислот — пальмитиновой [5]. Очевидно, что усиление "мягкого" разобщающего действия жирных кислот, содержащихся в митохондриях в небольших количествах, могло бы быть одним из путей антиоксидантной защиты этих органелл в условиях гиперпродукции активных форм кисло-
РАЗОБЩАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
185
рода, т.е. при окислительном стрессе. Недавно нами установлено, что в митохондриях, изолированных из печени старых крыс, в условиях инги-бирования перекисного окисления липидов ан-тиоксидантами, разобщающее действие пальми-тата в значительной степени подавляется физиологическими субстратами ADP/ATP- и ас-партат/глутаматного антипортеров ADP и аспар-татом [6]. При тех же условиях, но в отсутствие антиоксидантов, т.е. при окислительном стрессе, вызванном эндогенными процессами при старении, ADP и аспартат были не эффективны [6]. Было логичным предположить, что усиление окислительного стресса в митохондриях животных различного возраста независимо от вызвавшей его причины может приводить в результате к повышению разобщающей активности жирных кислот при участии ADP/ATP- и аспартат/глута-матного антипортеров. Такие события могут происходить путем устранения способности субстратов этих переносчиков ADP и аспартата ингиби-ровать процесс разобщения.
Цель настоящей работы — выяснить, как влияет развитие окислительного стресса в митохондриях животных на протонофорное разобщающее действие жирных кислот в присутствии физиологических субстратов ADP/ATP- и аспартат/глутаматно-го антипортеров. Для этого в митохондриях печени крыс зрелого и старческого возрастов в присутствии ADP и аспартата была исследована зависимость протонофорной разобщающей активности пальми-тата от интенсивности перекисного окисления ли-пидов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Опыты проводили на митохондриях, выделенных из печени белых крыс-самцов зрелого (9— 12 мес) и старческого (22—26 мес) возрастов общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот, как подробно описано ранее [4]. Дыхание митохондрий регистрировали полярографическим методом при температуре 25°С [5]. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозы, 20 мМ KCl, 5 мМ янтарной кислоты, 0.5 мМ EGTA, 2 мМ MgCl2, 5 мМ Mops— трис (рН 7.0). При исследовании разобщающего действия пальмитата в полярографическую ячейку сразу после митохондрий (~ 1.0 мг/мл) добавляли ротенон (2 мкМ) и олигомицин (2 мкг/мл), через 2 мин после этого 30 мкМ пальмитата, через следующие 1.5 мин — 200 мкМ ADP, через 1.5 мин — 3 мМ аспартат и еще через 1.5 мин — 50 мкМ 2.4-динитрофенола. Исследуемые агенты-модуляторы вносили в полярографическую ячейку сразу после добавки олигомицина и ротенона. Содержание диеновых конъюгатов, экстрагируемых из митохондрий гептаном, определяли спек-
трофотометрическим методом [7]. Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях при их инкубации в течение 5 мин определяли, как подробно описано ранее [6]. Перечень применяемого оборудования и используемых материалов приведен в работе [5].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В качестве потенциальных модификаторов разобщающего действия жирных кислот в опытах использовали окисляющий агент трет-бутилгидро-пероксид, антиоксидант тролокс и пируват. Как известно, инкубация митохондрий с трет-бутил-гидропероксидом приводит к окислению пиридиновых нуклеотидов и глутатиона. Это сопровождается образованием метильных и других свободных радикалов, а также повышением уровня продуктов перекисного окисления липидов — диеновых конъюгатов ([5] и цитируемая в этой статье литература). Тролокс — водорастворимый аналог а-токоферола известен как эффективный "уборщик" свободных радикалов [8]. Пируват, как показано нами ранее, добавленный к митохондриям при окислении сук-цината в присутствии ротенона, также проявляет эффективные антиоксидантные свойства [5]. В таблице приведены результаты исследования влияния вышеперечисленных модифицирующих агентов на дыхание митохондрий печени крыс зрелого возраста в отсутствие и в присутствии пальмитата и при последующем добавлении АЭР, аспартата и 2.4-ди-нитрофенола. Как видно из таблицы, ни один из модифицирующих агентов не влияет на дыхание митохондрий в отсутствие пальмитата, в присутствии только одного пальмитата и при максимальной стимуляции дыхания 2.4-динитрофенолом. АЭР и аспартат эффективно подавляли дыхание митохондрий, стимулированное пальмитатом, только в присутствии тролокса или пирувата, в то время как в присутствии трет-бутилгидроперокси-да, ни АЭР, ни аспартат были не эффективны (таблица). При одновременном присутствии тролокса и трет-бутилгидропероксида, а также и в отсутствие модифицирующих агентов, АЭР не обладал инги-биторным свойством, а аспартат подавлял стимулированное пальмитатом дыхание (таблица).
Необходимо отметить, что способность трет-бутилгидропероксида устранять действие аспар-тата не связана с индукцией кальций-зависимой неспецифической проницаемости внутренней мембраны, т.е. с функционированием неспецифической поры. В пользу этого свидетельствуют следующие факты: во-первых, эффект трет-бу-тилгидропероксида наблюдается в присутствии EGTA — хелатора, связывающего ионы кальция; во-вторых, как показано нами ранее [5] и в настоящей работе (данные не приведены), в присутствии трет-бутилгидропероксида карбокси-атрактилат совместно с аспартатом ингибирует
Влияние ADP и аспартата на стимулированное пальмитатом дыхание митохондрий печени крыс в отсутствие (контроль), в присутствии трет-бутилгидропероксида (ТБГ), тролокса и пирувата
Скорость дыхания, нмоль О2 / мин на 1 мг белка
Добавки Контроль ТБГ 50 мкМ ТБГ 100 мкМ Тролокс 30 мкМ Тролокс 30 мкМ + ТБГ 100 мкМ Пируват 7 мМ
Без добавок 11.5 ± 0.4 11.9 ± 0.7 11.8 ± 0.5 12.0 ± 0.3 11.9 ± 0.6 11.9 ± 0.5
Пальм 28.4 ± 0.7 29.1 ± 1.3 28.9 ± 1.1 28.3 ± 0.8 28.4 ± 1.4 28.2 ± 1.4
Пальм + ЛБР 28.1 ± 0.6 29.1 ± 1.3 28.9 ± 1.1 24.5 ± 1.0* 27.7 ± 1.3 23.4 ± 1.1*
Пальм + ЛБР + Асп 20.6 ± 0.5 26.1 ± 1.1* 27.8 ± 0.9* 17.5 ± 0.9* 20.1 ± 1.0 16.3 ± 0.8*
Пальм + ЛБР + Асп + ДНФ 78.2 ± 3.6 73.3 ± 2.5 74.4 ± 1.7 77.6 ± 3.5 79.5 ± 3.3 78.1 ± 3.6
Примечание. Условия опыта и состав среды инкубации описаны в экспериментальной части. Пальм — пальмитат 30 мкМ; ЛОР, 200 мкМ; Асп — аспартат 3 мМ; ДНФ — 2.4-динитрофенол 50 мкМ. Здесь и далее на
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.