УДК 577.121.1
РАЗОБЩЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ЛАУРИЛСУЛЬФАТОМ МОЖЕТ БЫТЬ ОПОСРЕДОВАНО ОСВОБОЖДЕНИЕМ СВЯЗАННЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ*
© 2006 г. Р.А. Симонян, А.В. Пустовидко, М.Ю. Высоких, В.П. Скулачев**
1 НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова Ленинские горы, 119992 Москва 2 Факультет биоинженерии и биоинформатики, МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва; электронная почта: skulach@genebee.msu.su
Поступила в редакцию 13.10.2006
Был исследован механизм разобщающего действия лаурилсульфата (ЛС). Известный факт, что разобщение низкими концентрациями лаурилсульфата (сильная кислота) сходно с разобщением жирными кислотами (слабые кислоты), свидетельствует против циклической схемы разобщения жирными кислотами, когда протонированная жирная кислота действует как протонофор. Обнаружено, что митохондрии печени и сердечной мышцы крыс могут быть разобщены низкими (70 мкМ) концентрациями ЛС. Это разобщение полностью предотвращается карбоксиатрактилатом (КАтр) — ингибитором АТР/АБР антипортера. С другой стороны, двукратное повышение концентрации ЛС вызывает разобщение митохондрий, нечувствительное к КАтр. Добавление олеиновой кислоты резко уменьшает КАтр-чувствительность разобщения митохондрий низкими концентрациями ЛС. Наблюдаемый феномен можно объяснить тем, что ЛС в низких концентрациях вызывает выход из митохондриальных депо эндогенных жирных кислот, ответственных за разобщение. В то же время, высокие концентрации ЛС вызывают неспецифическое (КАтр-независимое) повреждение мембраны митохондрий.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: разобщение, митохондрия, жирные кислоты, лаурил сульфат.
Предполагается, что механизм разобщения окислительного фосфорилирования митохондрий жирными кислотами опосредован циклическим перемещением жирных кислот в мембране [1—4]. Подобная схема предполагает, что анион жирной кислоты электрофоретически выбрасывается из матрикса митохондрии в межмембранное пространство, откуда он возвращается обратно в матрикс уже в протонированной форме. Последнее перемещение представляет собой простую диффузию свободной жирной кислоты через фосфолипидную мембрану, в то время как трансмембранное перемещение аниона жирной кислоты требует участия соответствующих белков. Предположительно эти белки
Принятые сокращения: AY — трансмембранная разность потенциалов; БСА — бычий сывороточный альбумин; КАтр — карбоксиатрактилозид; ЛС — лаурилсульфат; UCP — разобщающий белок.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, ВМ 06-257, 09.11.2006.
** Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
являются представителями семейства анионных митохондриальных переносчиков, таких как разобщающий белок (UCP), ATP/ADP-антипор-тер, аспартат/глутаматный переносчик, дикар-боксилатный и фосфатный переносчики и др. (для обзора см. [1—5]).
В соответствии с вышеприведенной схемой, в группах Гарлида и Ежека было показано, что за электрофоретический перенос таких сильных кислот как алкилсульфоновые, ингибирующих индуцируемую жирными кислотами протонную проводимость, несет ответственность разобщающий белок UCP1 [5]. Однако нами было показано [6], что лаурилсульфат (ЛС) — сильная кислота — в низких концентрациях увеличивает протонную проводимость митохондриальных мембран печени крысы. В этот процесс вовлечен ATP/ADP-антипортер, о чем свидетельствует влияние на процесс КАтр. Воздействие кати-онного (цетилтриметиламмонийбромида) или нейтрального (Triton Х-100) детергентов не зависит от КАтр, в то время как действие такого, например, ионного детергента, как холат натрия, в присутствии КАтр полностью блокируется. В
1677
дальнейшем нами были получены данные о поразительном соответствии многих параметров разобщения, индуцированного такими прото-нофорами, как ЛС и лауриновая кислота [7].
Для действия ЛС и олеиновой кислоты характерно следущее:
добавленные вместе, КАтр и глутамат полностью ресопрягают разобщенные под действием олеата или лаурилсульфата митохондрии;
увеличение рН способствует ресопряжению под действием КАтр и препятствует ресопряжению, индуцированному глутаматом, при этом влияние совместного ресопрягающего действия КАтр и глутамата не зависит от рН;
добавление ионов тетрафенилфосфония уменьшает КАтр-опосредованное ресопряже-ние, но не влияет на действие глутамата;
ресопрягающее действие атрактилозида значительно слабее, чем КАтр;
добавление атрактилозида перед КАтр уменьшает скорость ресопряжения;
ADP в низких концентрациях обладает более низкой в сравнении с КАтр ресопрягающей активностью;
GDP не обладает способностью ADP к ре-сопряжению.
Вплоть до недавнего времени оставалось неясным, как такая сильная кислота как ЛС может быть протонирована при нейтральном значении рН и может таким образом, участвовать в циклическом перемещении через мембрану митохондрии. Данный факт был использован Риалом и соавт. [8] в качестве аргумента против вышеупомянутой схемы механизма разобщающего действия жирных кислот. Однако в 2006 г. Ежек и соавт. [5] на модельной системе смеси липо-сом и насыщенного жирными кислотами БСА показали, что добавление ундеканосульфонатов приводит к такому же закислению внутреннего пространства липосом, как и в отсутствие альбумина. С другой стороны, добавление ундекано-сульфонатов к липосомам, преинкубированным с БСА, не содержавшим жирных кислот, подобного эффекта не вызывало. Эти явления можно объяснить возможностью замещения жирных кислот, связанных с БСА, на молекулы ундека-носульфоната. При этом высвободившиеся жирные кислоты протонируются и по градиенту концентрации транслоцируются внутрь липо-сом. Внутри липосом жирные кислоты депрото-нируются и индуцируют таким образом закис-ление среды. Сходные процессы наблюдались для митохондрий бурого жира, инкубированных с БСА. В этом случае, ундеканосульфонаты индуцировали разобщение, опосредованное жирными кислотами, вытесненными из комплекса с БСА. Данная гипотеза была подкреплена наб-
людением, что в отношении ундеканосульфона-тов, а также лаурилсульфата БСА обладает существенно более высоким сродством, чем для жирных кислот [9—12].
Приняв во внимание приведенные выше факты, мы исследовали воздействие ЛС на митохондрии печени и сердца крысы. Полученные данные находятся в согласии со следующими предположениями: при низких концентрациях ЛС вытесняет жирные кислоты из комплекса с белками митохондрий; КАтр-чувствительное разобщение, инициированное добавлением к митохондриям ЛС, опосредовано действием освободившихся жирных кислот. Что же касается высоких концентраций ЛС индуцированное таким образом КАтр-нечувствительное разобщение связано с неспецифическим повреждением мембран митохондрий. Таким образом, действие ЛС в больших концентрациях аналогично действию других детергентов и поверхностно-активных веществ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выделение митохондрий. Печень крысы весом 150—180 г, умерщвленной в соответствии с рекомендациями комитета по этике при МГУ им. М.В. Ломоносова, помещали в охлажденную до 0° среду выделения следующего состава: 10 мМ Мор8-КОН, рН 7,4, 250 мМ сахароза, 0,5 мМ EGTA, 0,1% БСА. Промытую ткань через 1 мин измельчали ножницами в стеклянном стаканчике на холоде на кусочки размером 2—3 мм, взвешивали и разрушали в течение 2 мин при 4° в гомогенизаторе Поттера (стекло—тефлон, зазор 200 мкм) в десятикратном объеме (объем/масса) среды выделения. Полученный гомогенат центрифугировали при 1000 g в течение 10 мин при 4° на центрифуге «Весктап», США, модель J2-21, ротор JA-20. Осадок отбрасывали и из суперна-танта при 9000 g (10 мин, 4°) осаждали митохондрии. Осадок ресуспендировали в 1 мл среды выделения, не содержавшей БСА. При выделении митохондрий сердца крысы промытую и измельченную на кусочки размером 4—5 мм ткань сердца пропускали через стальную давилку-пресс, охлажденную до 4°. Дальнейшее фраг-ментирование ткани проводили так же, как и для печени. Белок определяли биуретовым методом. Обычно, для митохондрий печени концентрация белка составляла около 100 мг/мл, для сердца — около 120 мг/мл.
Определение скорости дыхания и величины АА¥ для выделенного препарата мембран митохондрий. Мембранный потенциал определяли по распределению сафранина О [13]. Для этого на
РАЗОБЩЕНИЕ МИТОХОНДРИЙ ЛАУРИЛСУЛЬФАТОМ
1679
двухлучевом спектрофотометре Aminco DW-2000 (США) в двухволновом режиме измеряли соотношение поглощения сафранина О при 555/523 нм в суспензии митохондрий. Концентрация белка составляла 0,3—0,5 мг/мл, сафранина О — 15 мкМ, объем пробы 1 мл, длина оптического пути щелевой полиакриловой кюветы 1 см. Все измерения проводили при 25° в среде выделения, не содержавшей БСА. Скорость дыхания полученных препаратов митохондрий определяли по изменению содержания кислорода в закрытой кварцевой ячейке при помощи полярографа «Oroboros» (Австрия), с платиновым электродом Кларка. Митохондрии во всех случаях энергизо-вали внесением сукцината до концентрации 5 мМ в присутствии 2 мкМ ротенона и 1 мкг/мл оли-гомицина. В отдельных случаях, в среду измерения вносили КАтр до 1 мкМ, 2 мМ глутамат, 2 мг/мл БСА, 2 мкМ 2,4-динитрофенол.
Реактивы. Mops, сахароза, лауриновая кислота, лаурилсульфоновая кислота, янтарная кислота, олигомицин, ротенон, карбоксиатрак-тилозид, EGTA, 2, 4-динитрофенол, бычий сывороточный альбумин (специально очищенный от жирных кислот), глутаминовая кислота, сафранин О были получены от фирмы «Sigma» (США); гидроксид натрия, пентагидрат сульфа-
та меди, карбонат натрия были получены от фирмы <^еапа1» (Венгрия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Данные, представленные на рис. 1, иллюстрируют ресопрягающее действие КАтр в случае снижения величины для митохондрий печени (рис. 1 а, б) или сердца крысы (данные не представлены) при действии ЛС. В соответствии с нашими ранними наблюдениями [6, 7], КАтр полностью предотвращает разобщение, индуцируемое 70 мкМ ЛС. Однако увеличение концентрации ЛС вдвое позволяет преодолеть ингиби-рующее действие КАтр.
На рис. 2 представлены данные, иллюстрирующие действие трех различных веществ, обладающих ресопрягающим действием и обращающих ЛС-индуц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.