научная статья по теме РАЗРАБОТКА БЕЗАДЪЮВАНТНОЙ МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У МЫШЕЙ Биология

Текст научной статьи на тему «РАЗРАБОТКА БЕЗАДЪЮВАНТНОЙ МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У МЫШЕЙ»

IMMUNOPATHOGENETIC MECHANISMS OF INFLAMMATORY

POLYNEUROPATHIES

Shevchenko A. V.

Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, Russia

Today it is critical to study the immunologic mechanisms of autoimmune neuropathies and new opportunities for their early detection and clinical course forecasting, to develop best algorithms of pathogenetic and after-care treatment. The aim of our study is investigation of clinical presentation, neurophysiological tests data, and immunological parameters of CIDP in childhood. Levels of IgG and IgM autoantibodies against gangliosides (asialo- GM1, GM1, GM2, GD1a, GD1b, and GQ1b); interleukins (IL-2, IL-4, IL-10, TNF-a); specific IgG and IgE against myelin basic protein (MBP) and total serum IgE of children with chronic inflammatory demyelinating polyneuropathies (CIDP), multiple sclerosis (MS) with polyneuropathy and hereditary motor and sensory neuropathy (HMSN) Type I were measured for comparative analysis.

Key words: antiganglioside autoantibodies, chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, multiple sclerosis

РАЗРАБОТКА БЕЗАДЪЮВАНТНОЙ МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У МЫШЕЙ

Шиловский И. П., Бабахин А. А., Прозорова М. С., Гайсина А. Р., Камышников О. Ю., Хаитов М. Р.

Федеральное государственное бюджетное учреждение «<Государственный научный

центр «<Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства,

Москва, Россия

Бронхиальная астма (БА) является распространенным хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей. Для выяснения патофизиологии данного заболевания и для тестирования новых лекарственных средств чаще всего применяют острые адъю-вантные модели астмы. Такие модели БА являются краткосрочными, к тому же не в полной мере воспроизводят клиническую картину заболевания, а использование адъюванта не позволяет в последствии изучать на них адъювант-содержащие лекарственные средства. Поэтому главной целью данного исследования была разработка безадъювантной модели хронической бронхиальной астмы у мышей. В ходе работы был использован подкожный способ сенсибилизации мышей аллергеном, который позволил воссоздать основные признаки БА, такие как высокий уровень аллерген-специфических ^Е антител, профилирование иммунного ответа в сторону ^2, инфильтрация провоспалительных клеток в ткань легких и ремоделирование бронхов.

Ключевые слова: бронхиальная астма, воспаление, аллергены, цитокины

Введение. Бронхиальная астма (БА) это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, характеризующееся обратимой обструкцией и гипер-реактивностью бронхов. От БА страдает от 4 до 18% населения в разных странах, а смертность составляет порядка 250 тыс. в год [1, 4]. Также астма приводит к существенными экономическими потерям, в США расходы на лечение БА составляют 18 млрд. долларов США, а в Евросоюзе 17,7 млрд. евро

в год. В связи с этим, активно изучаются механизмы БА и создаются новые средства ее терапии. Значительная роль в изучении молекулярных механизмов БА и в тестировании новых противоастматических препаратов отводится мышиным моделям астмы.

Различают острые и хронические модели БА [6]. Острые модели успешно воссоздают некоторые клинические признаки заболевания, такие как: развитие аллергического воспаления

за счет эффекторных клеток (в частности эози-нофилов), гиперреактивность дыхательных путей. Данные модели менее трудоемки, поэтому используются наиболее часто. Хронические модели БА, помимо указанных признаков астмы, воспроизводят еще и ремоделирование бронхов, которое включает гипертрофию гладких мышц, гиперплазию бокаловидных клеток, утолщение субэпителиальной базальной мембраны, увеличение толщины стенок дыхательных путей, что ведет к необратимой обструкции дыхательных путей. Поскольку ремоделирование является едва ли не ключевым признаком БА, то хронические модели, несмотря на свою трудоемкость, в большей степени соответствуют клинической картине, наблюдаемой у человека [5, 7].

Для усиления развития признаков заболевания в большинстве хронических моделей применяют адъювант - гидроокись алюминия. Но его использование приводит к появлению стресса у животных, т.к. данное соединение имеет нефизиологическую природу; кроме того, его применение затрудняет изучение адъювант-содержащих препаратов, ввиду конкуренции адъюванта, использующегося в изучаемом препарате с адъювантом, использующимся в моделировании [2, 3].

Поэтому, целью данной работы было создание безъадьювантной хронической модели БА у мышей, отражающей основные клинические признаки заболевания.

Материал и методы. Исследования проводились на мышах самках BALB/c, в возрасте 6-8 недель, весом 20-22 г. В эксперименте изучались два варианта моделирования хронической БА - с адъювантом и без него. В обеих группах проводилась трехкратная сенсибилизация в дни 0, 14 и 28 модельным аллергеном -овальбумином (OVA). Через 12 дней и 33 дня после сенсибилизации осуществляли два этапа провокации (41-43 и 62-64 дни), путем интра-назального введения OVA в дозе 500 мкг/мышь. Третья группа животных никаким манипуляциям не подвергалась.

Через 7 дней после последней сенсибилизации (35 день), и на следующий день после первичной и вторичной провокации (44 и 65 дни) у лабораторных мышей забирали кровь, готовили сыворотку и проводили измерение уровней аллерген-специфических антител IgE, IgG2a, IgG1 с помощью ИФА. Через сутки после провокаций (44 и 65 дни) изучалась гиперреактивность бронхов методом неинвазивной плетиз-

мографии. Через двое суток после провокаций (45 и 66 дни) проводился забор бронхоальвео-лярного лаважа (БАЛ), его клеточный состав изучался с помощью цитометрии и световой микроскопии. Из клеток БАЛ была выделена РНК, для определения уровней экспрессии генов ГЬ-4 и №N7 методом ПЦР в реальном времени. Также в эти дни был произведен забор левого легкого для гистологического исследования.

Результаты и обсуждение. Значительную роль в патогенезе БА играют ^Е-антитела, они связываются с рецептором Fc£RI на тучных клетках, способствуя их дегрануляции и высвобождению медиаторов воспаления. Поэтому были изучены уровни специфических ^Е-антител в сыворотке крови методом ИФА. Установлено, что в обеих экспериментальных группах уровень ^Е был существенно выше чем у интакт-ных на всех этапах эксперимента. Однако при безаъювантном моделировании ^Е-ответ был выше, чем при адъювантном в два раза. Поскольку развитие аллергической реакции зависит от ^2/^1-баланса, то нами был изучен уровень специфических IgG2a-антител в сыворотке крови, которые являются маркерами ^1-от-вета. Было показано, что при адъювантном моделировании уровень IgG2a был выше, чем при безадъювантном примерно в два раза, на всех этапах эксперимента. Таким образом, повышение ^Е и снижение IgG2a у животных, подвергшихся безадъювантному моделированию свидетельствует о выраженном профилировании иммунного ответа в сторону аллергического ^2. Также был изучен уровень IgG1 антител, т.к. этот субкласс является маркером ^2-ал-лергического ответа, как и ^Е. Несмотря на низкий уровень ^Е, уровень IgG1 у животных, подвергшихся адъювантному моделированию был выше в семь раз по сравнению с безадъювант-ным. Такое изменение уровня антительного ответа можно объяснить участием алюминия в генерации IgG1 антител.

Общим патогенетическим признаком БА, является повышенная реактивность бронхов в ответ на воздействие физических и фармакологических факторов. Поэтому была изучена удельная сопротивляемость бронхов у экспериментальных мышей в ответ на аэрозольное введение им бронхоконстриктора (метахоли-на) методом неинвазивной плетизмографии. В результате, у животных при обоих способах моделирования сопротивляемость бронхов была выше, чем у интактных, что говорит

об успешном воспроизведении одного из ключевых признаков БА.

Одним из главных участников аллергического воспаления являются провоспалительные клетки, в частности эозинофилы, которые инфильтрируют в ткань легких и высвобождают медиаторы воспаления. Поэтому был изучен клеточный состав смывов легких (БАЛ), с помощью методов цитометрии и световой микроскопии. Было показано, что после первой провокации происходит трехкратное увеличение инфильтрации клеток в просвет бронхов при обоих способах моделирования. У модельных групп наблюдалась инфильтрация преимущественно про-воспалительных клеток: эози-нофилов, лимфоцитов и нейтрофилов. После второй провокации наблюдалась еще более выраженная (четырехкратная) инфильтрация про-воспалительных клеток.

При изучении гистологической картины воспаления в ткани легких было показано наличие слизистой метаплазии и гиперплазии эпителия бронхов и гипертрофии гладких мышц, что свидетельствует о ремоделировании бронхов у экспериментальных животных. Также в ткани легких обоих экспериментальных групп детектировалась инфильтрация эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов, что подтверждает развитие аллергического воспаления.

Известно, что значительную роль в индукции аллергического ^2-ответа и патогенезе БА играет ^-4, который активирует синтез ^Е-антител, способствует инфильтрации провос-палительных клеток, в частности эозинофилов и нейтрофилов в ткань легких и гиперреактивности бронхов. Поэтому нами был изучен уровень экспрессии ГЬ-4 в клетках, полученных из БАЛ методом ПЦР в реальном времени. Как оказалось, в обеих модельных группах экспрессия ГЬ-4 была в десятки раз выше, чем у интактных животных, как после первичной, так и после вторичной провокации, причем экспрессия ^-4 увеличивалась по мере увеличения количества провокаций аллергеном. После второй провокации экспрессия ГЬ-4 была в два раза выше у животных, подвергавшихся безадъювантному моделированию. Чтобы оценить изменения ^2/^1-балланса, также была изучена экспрессия ^N7, который является маркером ^1-иммунного ответа. Во всех экспериментальных группах экспрессия ^N7 была сходной. Таким образом, существенный рост экспрессии ^-4, при неизменном уровне №N7

позволяет утверждать, что именно безадъю-вантный способ моделирования приводит к более выраженному профилированию иммунного ответа в сторону Th2.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком