ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 211-218
УДК 571.27+579.61
РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ V АНТИГЕНА Yersinia pestis
© 2014 г. Т. А. Иващенко*, Е. В. Белова*, С. В. Дентовская*, С. А. Белькова**, С. В. Балахонов**, С. Г. Игнатов*, ***, И. Г. Шемякин*
*Государственный научный Центр прикладной микробиологии и биотехнологии, Оболенск, Московская область, 142279 **Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора,
Иркутск, 664047
*** Геологический факультет, Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992
e-mail: ignatov@obolensk.org Поступила в редакцию 16.06.2013 г.
Разработана иммуноферментная моноклональная тест-система для определения V антигена Yersinia pestis, которая по чувствительности и специфичности соответствует требованиям, предъявляемым к медицинским иммунобиологическим препаратам для идентификации возбудителей особо опасных инфекций. Определена чувствительность тест-системы, показана ее высокая специфичность, тест-система не выявляла клетки близкородственных (4 штамма Y. pseudotuberculosis, 3 штамма Y. entero-colitica) и гетерологичных штаммов микроорганизмов. Разработанная тест-система выявляла V антиген в концентрации до 2 нг/мл в клетках девяти опытных культур Y. pestis. Полученный препарат может быть рекомендован для лабораторной диагностики чумы.
DOI: 10.7868/S055510991402010X
Чума — особо опасное природно-очаговое острое инфекционное заболевание, вызываемое Yersinia pestis — единственным патогеном I группы опасности бактериальной природы. В настоящее время на территории многих стран мира, в том числе Российской Федерации и сопредельных с нею государств, находятся природные очаги чумы, активность которых подтверждается ежегодным выделением культур Y. pestis, что создает угрозу ее эпидемического распространения и является важным аспектом деятельности противочумных учреждений здравоохранения [1]. Кроме того, не следует исключать и возможность применения возбудителя чумы для осуществления биотеррористических целей. В связи с вышесказанным, быстрая индикация и идентификация возбудителя способствует оперативной организации и своевременному проведению противоэпидемических мероприятий, а при необходимости — выбору правильной стратегии лечения.
Все чаще традиционные, а порой и казавшиеся недавно перспективными методы диагностики оказываются недостаточными и принципиально неприемлемыми. В связи с этим возникает необходимость в разработке новых экспрессных методов диагностики и индикации, направленных на сокращение времени проведения анализа, его
упрощение при одновременном увеличении надежности и легкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности [2].
Стандартные иммунологические подходы диагностики чумы основываются на выявлении F1 антигена или антител к нему. Вместе с тем некоторые штаммы Y. pestis не продуцируют F1 антиген [3, 4], но при этом сохраняют вирулентность. Данный признак указывает на то, что F1 антиген не всегда является идеальной мишенью для определения возбудителя.
V антиген — полифункциональный фактор па-тогенности и один из основных протективных антигенов иерсиний представляет собой полипептид с молекулярной массой 37 кДа, кодируемый геном lcrV, расположенным на плазмиде вирулентности патогенных для человека представителей рода Yersinia [5]. Установлено, что V антиген ингибирует хемотаксис нейтрофилов и запускает механизм супрессии провоспалительных цитоки-нов [6]. Этот белок регулирует работу многокомпонентной системы секреции белков и опосредованно влияет на транскрипцию их генов, а также на перенос белков-эффекторов внутрь эукариотической клетки-мишени [7]. V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значи-
мых штаммах У. резИз [8] и может служить хорошей мишенью для идентификации патогена.
Для обнаружения антигенов возбудителей различных инфекционных заболеваний наиболее широкое распространение из иммунологических методов получил "сэндвич"-вариант твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Специфичность данного метода значительно выше других вариантов ИФА, так как индикация определяемого инфекционного агента происходит только при условии одновременного узнавания двух антигенных детерминант. Метод основан на использовании иммобилизованных и меченых антител с различной эпитопной специфичностью. По сравнению с конкурентным методом двухсайтовый ИФА потенциально более чувствителен и обладает тем преимуществом, что не требует очищенных антигенов [9].
Цель работы — конструирование иммунофер-ментной моноклональной тест-системы для обнаружения V антигена У. рвзИз в биологическом материале, а также для идентификации с ее помощью выделенных культур возбудителя чумы.
МЕТОДИКА
Штаммы микроорганизмов. В работе использовали штаммы возбудителя чумного микроба и близкородственных микроорганизмов, полученные из Музея живых культур Иркутского научно-исследовательского противочумного института (табл. 1).
Все штаммы чумного микроба обладали типичными видовыми/подвидовыми биологическими свойствами. Штаммы близкородственных иерсиний и гетерологичных микроорганизмов обладали типичными свойствами.
Среды и условия культивирования. Свежие культуры У. рвзИз индуцировались для секреции LcrV в условиях низкой концентрации кальция (<2 мМ) на агаре Хоттингера (рН 7.2) с 0.02 М ок-салатом натрия и 0.02 М М§С12 в течение 72 ч при температуре 37°С. Число жизнеспособных клеток определяли путем высева серийных разведений культуры на чашки с агаром Хоттингера.
Получение гибридом. Мышей линии BALB/c иммунизировали препаратом рекомбинантного
V антигена У. рвзИз [10] по общепринятой методике [11]. На 3 сут после последней иммунизации проводили гибридизацию спленоцитов иммунных мышей с клетками мышиной миеломы Р3-Х63 А§/8-653.
Двухсайтовый дот-блот анализ. Комбинацию моноклональных антител (МКА), обеспечивающую наибольшую чувствительность детекции
V антигена, определяли в двухсайтовом дот-блот анализе. Препараты МКА в 10 мМ фосфатно-со-левом буфере (ФСБ), рН 7.4 наносили на 0.22 мкм
нитроцеллюлозную мембрану ("GE Healthcare", UK) в количестве 2 мкл, что соответствует 3 мкг на пятно и высушивали на воздухе. Участки неспецифического связывания блокировали в 20 %-ном растворе фетальной сыворотки в 10 мМ ФСБ (рН 7.4) при температуре 37 °C в течение 30 мин. После блокирования нитроцеллюлозные мембраны трижды отмывали 10 мМ ФСБ (рН 7.4), содержащим 0.05%-ный Твин 20 (ФСБ-Т), "BioRad", США. V антиген суспендировали в 10 мМ ФСБ (рН 7.4) в соотношении 1 : 500, наносили на мембрану и инкубировали в течение 1 ч на шейке-ре при температуре 37°С, затем 4 раза промывали ФСБ-Т. Биотинилированные МКА вносили заведомо в избытке (разведение 1 : 500), инкубацию и промывку мембраны проводили четырехкратно, как описано выше. После этого мембраны выдерживали 45 мин при температуре 37°C с конъюга-том стрептавидин-пероксидаза хрена ("Имтек", Россия) в разведении 1 : 5000 в 10 мМ ФСБ (рН 7.4) согласно инструкции по применению. Далее нитроцеллюлозные мембраны отмывали еще раз и выдерживали в растворе, состоящем из 10 мМ ФСБ (рН 7.4) с 0.5 мг/мл диаминобензиди-на, 0.1 мг/мл NiCl2 и 1.0 мкл/мл 33 %-ного H2O2, вносимого до появления окрашивания (10 с). Реакцию останавливали промыванием нитроцел-люлозных мембран в дистиллированной воде. Учет результатов проводили визуально по интенсивности окрашивания пятна.
Биотинилирование МКА к V антигену Y. pestis.
Биотинилирование антител проводили по методу Дака [12] при помощи биотин^-гидросукцини-мидного эфира ("Sigma", США).
Приготовление иммунопероксидазных конъюга-тов на основе МКА к V антигену Y. pestis. При получении иммунопероксидазных конъюгатов в качестве лиганда использовали МКА к V антигену Y.pestis. К 5 мг пероксидазы хрена ("Sigma", США) добавляли 1.0 мл 0.3 М NaHCO3 и 0.025 мл 0.32% формалина. Полученную смесь инкубировали при температуре 22°С на шейкере (300 об/мин) в течение 30 мин. Далее в реакционную смесь вносили 1.0 мл 0.04 М NaIO4, инкубировали при температуре 22° С и перемешивании в темноте в течение 20 мин, затем добавляли к реакционной смеси 1.0 мл 0.16 М этиленгликоля, выдерживали 1 ч при температуре 22°С на шейкере (300 об/мин) и диализовали против 0.01 М карбонат-бикарбо-натного буфера (рН 9.6) при температуре 4°С в течение ночи. Таким образом получали активированную пероксидазу хрена, имеющую на поверхности активные альдегидные группы. Для образования ковалентных связей между альдегидными группами пероксидазы и аминогруппами антител к 3 мл активированной пероксидазы хрена добавляли 1.0 мл раствора МКА с содержанием белка 2.5 мг/мл и инкубировали 2 ч при тем-
Таблица 1. Характеристика штаммов, использованных в работе
Штамм Характеристика Источник и дата выделения
Yersiniapestis subsp. pestis
262-264 pFra+, pCad+, pPst+ Тувинский природный очаг
И-2638 pFra+, pCad+, pPst+ Там же, 1977 г.
403 pFra+, pCad+, pPst+ Там же, 2009 г.
1559 pFra+, pCad+, pPst+
И-1988 pFra+, pCad+, pPst+ Забайкальский природный очаг, 1970 г.
EV линия НИИЭГ pFra+, pCad+, pPst+, Apgm Мадагаскар, 1926 г, линия штамма ЕУ, поддерживаемая в России для производства живой чумной вакцины
Yersinia pestis subsp. altaica
1528 pFra+, pCad+, pPst+ Горно-Алтайский природный очаг, 2011 г.
1464 pFra+, pCad+, pPst+
И-3546 pFra+, pCad+, pPst+ Там же 1973 г.
И-2377 pFra+, pCad-, pPst+ авирулентный
И-2359 pFra+, pCad+, pPst+
Yersinia pestis subsp. ulegeica
И-2422 pFra+, pCad+, pPst+ Северо-запад Монголии, 1974 г.
Yersinia pestis subsp. hissarica
И-2705 pFra+, pCad+, pPst+ Таджикская ССР, 1972 г.
Yersinia pseudotuberculosis
И-53 рСаё+, серотип О:1, 1958 г., Сахалинская обл.
И-716 рУМ80+, серотип О:1, рСаё+ 1987 г., Алтайский край
И-722 рСаё+, серотип неизвестен 1985 г., Якутская АССР
159 рСаё+, серотип неизвестен Приморский край, р. Крепостная, 1962 г.
185 рСаё+, серотип О:1 Нижний Новгород
И-748 рСаё+, серотип О:1 Ангарск, Иркутская область, 1998 г.
Yersinia enterocolitica
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.