МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, том 46, № 6, с. 827-845
= ОБЗОРЫ
УДК 577.2.08
РАЗРАБОТКА И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА КОРОТКИХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК © 2012 г. В. В. Гринев*
Кафедра генетики биологического факультета Белорусского государственного университета,
Минск, 220030, Республика Беларусь Поступила в редакцию 11.01.2012 г. Принята к печати 16.02.2012 г.
Обзор посвящен анализу правил подбора высокоэффективных и высокоспецифичных коротких интерферирующих РНК фРНК), а также требований, предъявляемых к их качеству. В обзоре подробно рассмотрены четыре ключевых этапа разработки таких 81РНК: выбор целевой РНК, подбор нуклеотидной последовательности смысловой и антисмысловой цепей соответствующей 81РНК, оценка активности и специфичности действия полученных 81РНК. Особое внимание уделено правилам подбора нуклеотидной последовательности 81РНК, который проводят с учетом особенностей структурной и термодинамической организации, а также нуклеотидного состава 81РНК, структурно-термодинамической организации молекулы целевой РНК при детальной проработке условий эксперимента с использованием 81РНК. В обзоре также дан анализ биоинформационных ресурсов, используемых при проектировании 81РНК. Изложенная и критически проанализированная в обзоре информация может быть полезной при разработке 81РНК, коротких шпилечных РНК ^ИРНК) и/или искусственных микроРНК (ат1РНК) для целей функциональной геномики и экспериментальной генной терапии.
Ключевые слова: РНК-интерференция, короткие интерферирующие РНК, правила разработки, оценка активности, оценка специфичности действия.
DESIGN AND QUALITY CONTROL OF SHORT INTERFERING RNAs, by V. V. Grinev* (Department of Genetics, Faculty of Biology, Belarusian State University, Minsk, 220030 Republic of Belarus; *e-mail: grinev_vv@bsu.by). Review is devoted to analysis of design rules as well as quality controls in development of high effective and specific short interfering RNA (siRNA). Four crucial steps in development of such siRNAs are discussed: choice of target RNA, design of sense and antisense strands as well as assessment of activity and specificity of corresponding siRNAs. The special consideration is given to siRNA construction principles which are based on both structural and thermodynamical features and nucleotide composition of siRNAs as well as structural and thermodynamical properties of target RNA and features of experiment performance. Bioinfor-matics resources for development of siRNAs are also discussed. The information from this review can be useful for development of high effective and specific siRNA, short hairpin RNA (shRNA) and/or artificial microRNA (amiRNA) sequences for gene therapy and functional genomics purposes.
Keywords: RNA-interference, short interfering RNA, design rules, assessment of activity, assessment of specificity.
ВВЕДЕНИЕ
РНК-интерференция (РНК!) — это один из механизмов специфичного к последовательности контроля экспрессии генов на посттранскрипционном уровне, ключевую роль в котором играют короткие двухцепочечные молекулы РНК, именуемые короткими, или малыми, интерферирующими РНК ^РНК). Общие структурные особен-
ности организации таких дуплексов включают следующие параметры (рисунок): 1) в состав РНК-дуплекса входят две цепи длинной от 18 до 29 н. — смысловая (цепь-"пассажир") и антисмысловая (рабочая цепь, цепь-"гид"); 2) РНК-дуплекс обладает структурно-термодинамической асимметричностью; 3) для распознавания целевой (или нецелевой) молекулы РНК важ-
Принятые сокращения: amiPHK (artificial microRNA) — искусственные микроРНК; CDS (coding sequence) — кодирующая белок последовательность; miPHK (microRNA) — микроРНК; siPHK (small interference RNA) — малые, или короткие, интерферирующие РНК; shPHK (short/small hairpin RNA) — короткие шпилечные РНК; UTR (untranslated region) — нетранс-лируемая область мРНК; РНЮ — РНК-интерференция.
* Эл. почта: grinev_vv@bsu.by
3
^Vc ~Г> !ТЧ
4 TA'-P-Nr N N3. N4. N5 N N7 N8' N9. N1oN11N12N13.N14N15N16N17N18N19N2oN2.r-iOH-_3;_i .......................••• .......... 4
3'-OH-N21N20NBN18N17N16N15N14N13N12N11N1oN^jN8 N7 N N5 N4 N3 ^^¡-Р^
..........................................5......................................N3
-V-5-' 3
2
Структурная организация синтетических 81РНК. Нуклеотидная последовательность 81РНК записана с помощью условных обозначений: N1', N2', N1' — нуклеотиды смысловой цепи; N1, N2, N1 — нуклеотиды антисмысловой цепи. Фигурной скобкой 1 показана смысловая цепь 81РНК, фигурной скобкой 2 — антисмысловая цепь. Пунктирными прямоугольниками выделены 5'-фосфатный конец (3), З'-ОН-конец с двумя выступающими нуклеотидами (4) и "запальная" область (5).
ны 5'-концевые нуклеотиды (со 2-го по 8-й) антисмысловой цепи — это так называемая "запальная" область ("8ееё"-регион); 4) на обоих З'-концах РНК-дуплекса находится по два неспа-ренных выступающих нуклеотида.
Источником 81РНК могут быть эндогенные длинные двухцепочечные РНК, которые образуются с помощью клеточных или вирусных РНК-зависимых РНК-полимераз. Кроме того, внутриклеточные двухцепочечные РНК, как источник 81РНК, могут появляться в результате транскрипции инвертированных повторов и генов мик-роРНК (т1РНК). Наконец, 81РНК могут иметь и искусственное происхождение — от синтетических до образующихся в результате внутриклеточного процессинга экзогенных молекул длинных двухцепочечные РНК, а так же коротких шпилечных РНК (бЬРНК) или искусственных микроРНК (ат1РНК). Более подробно о самом явлении РНК1 читатель может узнать из специализированных обзоров (например, [1]).
Вскоре после открытия РНК1 стало понятно, что это явление можно использовать в функциональной геномике и экспериментальной геноте-рапии. Данный вывод основан на следующих соображениях: 1) РНК1 как механизм контроля экспрессии генов у эукариот — природное явление, а не лабораторный феномен; 2) РНК1 протекает при участии нескольких ферментативных систем, что предполагает усиление интерферирующего сигнала (это означает, что для запуска РНК1 достаточно, теоретически, единичных молекул 81РНК); 3) РНК1 представляет собой высокоспецифичный механизм контроля экспрессии генов у эукариот на посттранскрипционном уровне; 4) источником 81РНК могут быть 8ИРНК и/или ат1РНК, что позволяет переносить их в клетки с помощью плазмидных или вирусных векторов и контролировать наработку в этих клетках.
Очевидно, что для успешного использования РНК1 в геномных исследованиях или генной терапии необходимы 81РНК, обладающие высокой активностью и специфичностью. Алгоритм разработки таких 81РНК включает четыре последова-
тельных этапа: 1) выбор целевой РНК, 2) подбор нуклеотидной последовательности смысловой и антисмысловой цепей 81РНК, 3) оценка активности 81РНК и 4) оценка специфичности их действия.
ВЫБОР ЦЕЛЕВОЙ РНК ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РНК!
Наиболее общие представления о структуре целевого гена и разнообразии его РНК-продуктов могут быть получены с помощью геномных обозревателей (браузеров), самые популярные из которых UCSC Genome Browser [2] и Ensembl [3]. Такого рода геномные обозреватели проводят автоматическую аннотацию (краткое описание) геномов, используя для этого информацию из регулярно обновляемых специализированных баз данных типа NCBI Reference Sequences [4] или GenBank [5]. В зависимости от характера запроса пользователя, интегрированные обозревателем данные могут быть представлены в графическом или текстовом виде, удобном для их дальнейшего анализа. При необходимости массивы данных могут быть переданы пользователю по стандартным протоколам файлового обмена FTP или HTTP и подвергнуты дальнейшему анализу на локальном компьютере.
Однако, несмотря на все плюсы и удобства в использовании, геномные обозреватели дают лишь краткое описание структурно-функциональной организации для запрашиваемого локуса, более же подробная информация может быть получена из специализированных баз данных или литературных источников. При этом для решения задач проектирования и оценки качества siPHK самой значимой считается информация о вариабельности целевого гена, структуре и разнообразии его РНК-транскриптов, а также характере их редактирования.
Наиболее общая, но систематизированная информация о вариабельности целевого гена может быть получена через портал Varietas, который интегрирован с различными внешними геномными
1
базами данных и позволяет быстро получать доступ к интересующим пользователя сведениям [6]. Подробная же информация по тем или иным формам такой вариабельности содержится в специализированных базах данных. Так, в базе данных NCBI dbSNP к настоящему моменту собраны сведения о 121566683 сайтах однонуклеотидного полиморфизма 86 организмов (в том числе o 41365 915 сайтах по геному человека) [7, 8]. Расширенные данные о варьировании копийности, инсерциях, делециях, инверсиях или транслокациях целевого гена содержатся в регулярно обновляемой базе OMIM, где собраны сведения о 12 000 генов человека [9], или базе данных NCBI dbVar [8].
Самой важной информацией для проектирования 81РНК служит информация о разнообразии РНК-продуктов целевого гена. К сожалению, в настоящее время не существует единой и всеобъемлющей базы данных, содержащей сведения о точках начала транскрипции (и, как следствие, 5'-концах молекул РНК), сигналах и сайтах по-лиаденилирования (и, как следствие, З'-концах молекул РНК), стартовых кодонах, стоп-кодо-нах, составе и структуре кодирующих белок последовательностей (CDS), а также об альтернативных вариантах сплайсинга РНК-транскрип-тов. Поэтому для получения как можно более полного представления об РНК-транскриптах целевого гена целесообразно провести системный анализ ряда баз данных.
Первоначальный анализ может быть начат с базы данных NCBI Reference Sequences [4], где на 15 июля 2011 года депонирована надежная информацию о структуре 2634630 РНК-транскриптов (референс-последовательностей) для 12235 видов организмов. Но, к сожалению, эти сведения нельзя считать полными. Так, согласно NCBI Reference Sequences, ген RUNX1T1 человека может транскрибироваться с образованием 15 альтернативных РНК-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.