БИОЛОГИЯ ВНУТРЕННИХ ВОД, 2014, № 3, с. 106-112
УДК 581.526.325.2
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ВЫЯВЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЦИСТИНОВ
© 2014 г. О. С. Моренков*, В. В. Врублевская*, Н. В. Кочкина**, А. Л. Ковтун**
*Институт биофизики клетки РАН, 142290 г. Пущино, ул. Институтская, 3,
e-mail: morenkov_o@mail.ru **Научный центр "Сигнал", 107014г. Москва, ул. Большая Оленья, 8 Поступила в редакцию 10.04.2013 г.
Разработан непрямой конкурентный иммуноферментный анализ для количественного определения микроцистинов в воде (МЦ-ИФА) с использованием полученных МЦ-специфических полик-лональных антител. Пороговая концентрация наиболее распространенного и высокотоксичного МЦ-LR, достоверно выявляемая с помощью МЦ-ИФА, составляла 0.05 ± 0.01 нг/мл, 50%-ная ин-гибирующая концентрация — 0.41 ± 0.05 нг/мл, диапазон количественного определения МЦ-LR — 0.1—5.0 нг/мл. Разработанный МЦ-ИФА достоверно выявил МЦ-LR в воде при его концентрациях в 10—20 раз ниже установленного Всемирной организацией здравоохранения допустимого уровня содержания МЦ в питьевой воде и в 100—200 раз ниже допустимого уровня содержания МЦ в водоемах. С помощью МЦ-ИФА выявлялась группа перекрестно-реагирующих МЦ и нодуларин. Разработанный метод можно использовать для мониторинга содержания МЦ в водоемах и питьевой воде.
Ключевые слова: синезеленые водоросли, микроцистины, иммуноферментный анализ.
DOI: 10.7868/S0320965214030140
ВВЕДЕНИЕ
"Цветение" воды возникает в связи с массовым размножением в пресных водоемах фикопланкто-на — в основном синезеленых водорослей. Очень часто такое цветение вызывают микроводоросли родов Anabaena, Anabaenopsis, Hapalosiphon, Microcystis, Nostoc, Planktothrix, Phormidium и Synechococ-cus, которые способны продуцировать фикоток-сины, обладающие преимущественно гепатоток-сическим действием — микроцистины (МЦ) [2, 11, 28, 32]. Микроцистины относятся к циклическим гептапептидам, содержащим две изменяемых и пять неизменяемых аминокислот [11, 28, 32], которые синтезируются ферментными комплексами, состоящими из нерибосомальных пепти-дсинтетаз и поликетид синтаз [13]. Все МЦ имеют сходную структуру (рис. 1). Одна из неизменяемых аминокислот МЦ — уникальная бета-аминокислота, называемая ADDA (3-амино-9-метокси-2,6,8-триметил- 10-фенил-дека-4,6-диеноевая кислота). Двухбуквенный суффикс (XY) приписывается каждому индивидуальному МЦ для обозначения изменяемых аминокислот. В зависимости от состава изменяемых аминокислот микроцистины характеризуются не только различными физико-химическими свойствами, но и токсичностью. Идентифицировано >80 различных видов МЦ, из них наиболее распространен и высокотоксичен МЦ-LR (Х — лейцин, Y — аргинин).
Микроцистины устойчивы к повышенным температурам (в том числе к кипячению) [15], солнечному свету (особенно при наличии в воде водорастворимых пигментов) [34], окислению и гидролизу. Это приводит к тому, что МЦ очень стабильны в естественных условиях и могут сохраняться неделями и даже месяцами при попадании в воду после разрушения клеток синезеленых водорослей [10]. В периоды "цветения" содержание МЦ в воде может превышать допустимые концентрации в тысячи раз, приближаясь к суб-
CO2H
HN
Adda
O O" \
NH
NH
Y
O CO2H
Рис. 1. Обобщенная структура микроцистинов — цик-ло-ф-Ак-Х^-МеАф^-Аааа^-ОЬ-МсЛа): D-Ala -D-аланин; D-MeAsp — D-эритро-Р-метиласпараги-новая кислота; Adda — 3-амино-9-метокси-2,6,8-три-метил-10-фенил-дека-4,6-диеноевая кислота; D-Glu — D-глутамат; Mdha — N-метилдегидроаланин. Х и Y — изменяемые аминокислоты в различных видах мик-роцистинов.
летальным. Через потребление контаминирован-ной воды, микроводорослей и других гидробион-тов, содержащих МЦ, происходит заражение рыб, моллюсков, а также остальных участников пищевой цепи [37]. Зарегистрированы многочисленные случаи отравления и гибели рыб, птиц, диких и домашних животных в периоды "цветения" воды [5, 9, 19, 33]. Описаны случаи отравления людей, связанные с МЦ [16]. Хроническое попадание МЦ в организм человека может привести к развитию онкологических заболеваний [14]. Это связано со способностью МЦ ингибировать фосфатазы РР1 и РР2А [29], которые играют важную роль в супрессии опухолей [14].
В России МЦ обнаружены в воде Свирской и Волховской губы Ладожского озера [35], в оз. Сестрорецкий разлив, у берегов Финского залива близ впадения р. Сестра [6], в Усть-Илим-ском водохранилище, оз. Котокельское (Бурятия) [1, 7, 8], в Шершневском водохранилище Челябинской обл. [4], Цимлянском водохранилище [3] и др. Летом 2008 г. в оз. Котокельское зарегистрирована массовая гибель рыб, водоплавающих птиц и домашних животных, отмечены 16 случаев отравлений человека, связанных с употреблением в пищу рыбы, выловленной в озере. Установлено, что причинами этому были продуценты МЦ [1, 5].
Для анализа МЦ в воде используют различные физико-химические, иммунохимические и биологические методы [11, 22]. Наиболее перспективными, сочетающими в себе простоту, скорость, высокую чувствительность и специфичность, считаются иммунохимические методы выявления МЦ. Разработан ряд иммунохимиче-ских методов выявления МЦ, в основном в формате иммуноферментного анализа (ИФА). Результаты, получаемые ИФА-методом, хорошо коррелируют с данными других методов, в том числе методов высокоэффективной жидкостной хроматографии [22]. ИФА-методы основаны на применении как поликлональных, так и моно-клональных МЦ-специфических антител [17, 21, 23-25, 27, 30, 31, 36, 38, 39]. Недостаток последних — их высокая специфичность к отдельным представителям МЦ, что приводит к невозможности выявления широко спектра МЦ. Результаты, полученные с использованием ИФА на основе поликлональных антител, более надежны в выявлении суммарных микроцистинов в воде, так как поликлональные антитела обычно перекрестно реагируют с большим набором структурно -близких МЦ.
Для иммуноферментного определения содержания МЦ в воде используются различные тест-системы зарубежных компаний (например, ABRAXIS (США), "EnviroLogix Inc." (США), "Strategic Diagnostics" (США), "Abnova" (Тайвань) и "Tokiwa Chemical Industries" (Япония)).
Отечественные разработки иммуноферментных тест-систем для определения МЦ отсутствуют, в связи с этим для проведения анализа воды на содержание МЦ используются дорогостоящие зарубежные тест-системы.
Цель работы — разработка чувствительного и специфичного иммуноферментного метода обнаружения и количественного определения МЦ в пробах воды.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для синтеза конъюгатов МЦ с белковыми носителями использовали МЦ-ЬЯ. Получение конъюгатов МЦ-ЬЯ с бычьим сывороточным альбумином (БСА), гемоцианином (КЬН) и овальбумином (ОВА) осуществляли по карбоксильной группе МЦ-ЬЯ с использованием водорастворимых кар-бодиимидов [12] или путем взаимодействия дегид-роаланина МЦ-ЬЯ с тиолированными белками [24]. Для получения МЦ-специфических антител (а-МЦ-АТ) кроликов иммунизировали антигенами МЦ-ОВА и МЦ-КЬН, эмульгированными в полном адъюванте Фрейнда (первая иммунизация) или в неполном адъюванте Фрейнда (последующие иммунизации). Животных иммунизировали подкожно, интервалы между иммунизация-ми 2 нед, дозы иммунизации 30—100 мкг на одну иммунизацию. Через 14 сут после иммунизаций у кроликов отбирали кровь и получали антисыворотку.
Иммуноглобулины выделяли из антисывороток стандартными методами с помощью хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе [26]. Чистоту препаратов антител оценивали с помощью электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия [18]. Концентрацию белков определяли методом Лоури [20].
Активность антисывороток и препаратов очищенных а-МЦ-АТ оценивали с помощью непрямого ИФА с использованием для сенсибилизации планшетов МЦ-БСА. Связавшиеся на твердой фазе а-МЦ-АТ выявляли с помощью пероксидазных конъюгатов против 1§С кролика ("Зи^ес", STAR174). Реакцию проявляли с помощью 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ). За титр а-МЦ-АТ принимали максимальное разведение антисывороток или очищенных а-МЦ-АТ при котором оптическая плотность (ОП450) превышала 0.3.
Определение МЦ в растворе проводили с помощью непрямого конкурентного ИФА, используя планшеты, на которых был сорбирован и высушен МЦ-БСА. На первом этапе в лунках инкубировали а-МЦ-АТ и исследуемые образцы воды, содержащие или не содержащие МЦ-ЬЯ. После промывки в лунках инкубировали пероксидаз-ный конъюгат против 1§С кролика. Реакцию проявляли с помощью ТМБ, определяли ОП450 и вы-
Таблица 1. Характеристика антисывороток против МЦ-ЬЯ
Иммуно-ген Метод пришивки МЦ-ЬЯ к носите- Доза им-муноге- Количество им- Титр МЦ-специ-фических анти- Ингибирование сигнала в конкурентном ИФА при разных концентрациях МЦ-ЬЯ, %
лю через на, мкг мунизаций тел 0.5 нг/мл 20.0 нг/мл
150 100 2 4.22 ± 0.43 56.3 ± 4.1 90.3 ± 7.3
3 4.78 ± 0.57 45.8 ± 3.3 75.3 ± 6.7
карбоксильную 4 5.34 ± 0.52 34.3 ± 4.3 69.5 ± 5.6
группу МЦ-ЬЯ 550) 350 2 3.13 ± 0.35 59.6 ± 5.5 88.5 ± 8.1
3 3.52 ± 0.48 50.4 ± 5.1 70.9 ± 6.1
МЦ-КЬН 4 4.37 ± 0.50 42.5 ± 4.5 59.8 ± 5.7
150 100 2 2.96 ± 0.27 54.3 ± 5.7 85.9 ± 6.9
3 3.94 ± 0.55 46.6 ± 3.8 58.5 ± 4.9
дегидроаланин 4 4.15 ± 0.43 43.3 ± 3.2 48.8 ± 4.4
МЦ-ЬЯ 50 3)0) 2 2.34 ± 0.29 51.7 ± 5.9 81.6 ± 8.5
3 2.95 ± 0.38 50.1 ± 5.8 73.2 ± 7.8
4 3.44 ± 0.52 40.8 ± 5.5 66.3 ± 7.2
150 100 2 4.12 ± 0.38 59.3 ± 4.9 91.6 ± 9.2
3 4.88 ± 0.53 44.7 ± 5.1 81.9 ± 8.1
карбоксильную 4 5.14 ± 0.64 29.9 ± 3.5 67.1 ± 6.3
группу МЦ-ЬЯ 50 3)0) 2 3.51 ± 0.38 64.3 ± 5.3 89.8 ± 7.8
3 3.72 ± 0.33 54.8 ± 5.8 77.3 ± 6.9
МЦ-ОВА 4 4.27 ± 0.55 45.3 ± 5.2 73.2 ± 8.1
150 100 2 3.14 ± 0.33 54.8 ± 4.5 81.9 ± 8.4
3 3.54 ± 0.56 49.5 ± 4.7 51.9 ± 3.9
дегидроаланин 4 4.32 ± 0.61 40.0 ± 3.9 65.5 ± 5.6
МЦ-ЬЯ 50 3) 0 2 2.46 ± 0.28 49.2 ± 5.0 73.2 ± 6.2
3 2.94 ± 0.47 44.3 ± 5.1 73.1 ± 7.9
4 3.33 ± 0.37 36.2 ± 4.4 68.1 ± 6.1
Примечание. Над чертой — первая, под чертой — повторные иммунизации.
числяли процент ингибирования сигнала ИФА относительно контроля (лунки без МЦ-ЬЯ). Оценку перекрестной реактивности различных видов МЦ проводили с помощью конкурентного непрямого ИФА,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.