научная статья по теме РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИГЕНОВ HELICOBACTER PYLORI Химия

Текст научной статьи на тему «РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИГЕНОВ HELICOBACTER PYLORI»

ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 5, с. 520-530

УДК 543.645:57.083.3

РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ АНТИГЕНОВ Helicobacter pylori

© 2015 г. Н. А. Вызова*, А. В. Жердев*, П. Г. Свешников**, Э. Г. Садыхов*, Б. Б. Дзантиев*

*Институт биохимии им. А.Н. Баха, РАН, Москва, 119071 e-mail: nbyzova@inbi.ras.ru **Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва, 117638

e-mail: petersveshnikov@list.ru Поступила в редакцию 31.03.2015 г.

Разработана тест-система для экспрессной детекции антигенов Helicobacter pylori, основанная на принципе иммунохроматографии в "сэндвич"-формате. Контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами инициирует движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимические взаимодействия и формирование детектируемых зон, окрашенных на-ночастицами золота. Изучены концентрационные и кинетические закономерности иммунохими-ческих взаимодействий. Предложена реагентная и мембранная комплектация тест-системы, обеспечивающая минимальный предел обнаружения. Показано, что разработанная тест-система позволяет за 10 мин детектировать антигены клеточной стенки H. pylori в концентрациях до 0.3 мкг/мл в водных растворах и суспензии кала клинической пробы. Усиление окрашивания при добавлении солей серебра позволяет снизить предел обнаружения до 0.03 мкг/мл. Разработанная тест-система может быть использована для внелабораторной диагностики.

Ключевые слова: экспрессная детекция антигенов, Helicobacter pylori, иммунохроматография в "сэндвич"-формате, иммунохроматографические тест-системы.

DOI: 10.7868/S0555109915050049

Helicobacter pylori — спиралевидная грамотри-цательная бактерия, которая встречается в слизистой оболочке желудка человека и является причиной ряда гастроэнтерологических заболеваний [1, 2]. По данным K. Гоха и соавт., H. pylori инфицированы в мире от 10 до 90% взрослого населения в зависимости от региона [3].

На сегодняшний день в медицинской практике для обнаружения H. pylori используют бактериологические, гистологические (иммуногистологиче-ские), молекулярно-генетические, биохимические и иммунохимические методы (иммунофермент-ный анализ, ИФА, экспресс-тесты), каждый из которых обладает своими достоинствами и ограничениями [4, 5].

Бактериологические методы являются одними из наиболее информативных и специфичных [6]. Их преимущества — возможность выделения чистой культуры H. pylori, изучения ее морфологических, биохимических и биологических свойств, определения устойчивости возбудителя к антибиотикам. Вместе с тем недостатками методов являются длительность (до 5—10 сут) получения результатов, трудоемкость и опасность для персонала, низкая производительность, невозможность

определения кокковых форм H. pylori и другие факторы [7].

Гистологические методы и их иммунохимические модификации — наиболее специфичные методы диагностики H. pylori [6]. Они позволяют обнаружить бактерию в препаратах слизистой оболочки желудка, определить степень обсемененности и расположение микробных тел, форму бактерии, а также локализация H. pylori в тканях организма человека и наличие морфологических изменений слизистой оболочки желудка, связанных с инвазией микроорганизма [5]. К недостаткам методов следует отнести длительную подготовку гистологических образцов, техническую сложность и высокую стоимость.

Для детекции и идентификации H. pylori, а также лабораторного подтверждения диагноза используют также метод полимеразной цепной реакции, позволяющий в течение 5—6 ч определить наличие в пробах биоптата или кала специфических последовательностей ДНК H. pylori — генов цитоксичности, продуцирующих факторы пато-генности микроорганизма (CagA, VacA, IceA и др.) [8, 9]. К ограничениям метода следует отнести длительность, специальные требования к услови-

ям проведения лабораторного тестирования и квалификации персонала.

Биохимические методы обнаружения H. pylori основаны на уреазной активности данного микроорганизма. Продукты гидролиза введенной пациенту мочевины — углекислый газ и аммиак — определяют в выдыхаемом воздухе [5]. Уреазные тесты дешевле и проще в использовании по сравнению с бактериальными и гистологическими методами, имеют сопоставимую с ними специфичность, однако чувствительность диагностики может снижаться при желудочных кровотечениях и частичной резекции желудка [5]. К ограничениям методов следует также отнести высокий уровень требований к условиям проведения анализа.

Иммунохимические методы позволяют фиксировать наличие антигенов H. pylori в кале или антител к микроорганизму в сыворотке крови [10].

Иммуноферментное выявление антигенов H. pylori в кале высокочувствительно, специфично и признано стандартом в диагностике H. pylori у детей и взрослых как до, так и после проведения терапии [5]. Дальнейшее расширение применения данного метода ограничивают его продолжительность (от 2 до 4 ч), а также необходимость специализированного лабораторного оборудования.

Иммуноферментное выявление антител к H. pylori в крови применяется для скрининга частоты ин-фицированности в популяциях и для первичной диагностики инфекции. Однако этот метод малоинформативен при обследованиях детей в возрасте до 14 лет в связи с меньшей выраженностью иммунного ответа. С помощью этого метода невозможно различить прошедшую или текущую инфекцию, поэтому он не рекомендован для оценки эффективности уничтожения (эрадикации) H. pylori [11].

Выбор оптимального метода детекции H. pylori основывается прежде всего на его экспрессности и пределе обнаружения. Исходя из этих критериев, несомненными преимуществами обладают активно разрабатываемые в последнее время иммуно-хроматографические методы анализа [12]. При проведении иммунохроматографии (ИХ) контакт пробы с тест-полоской инициирует движение реагентов по мембранам тест-полоски и все происходящие при этом специфические реакции, завершающиеся окрашиванием определенных ее зон. Наличие или отсутствие окрашивания позволяет сделать вывод о результатах тестирования, причем для этого вывода достаточно визуальной оценки. Таким образом, ИХ обеспечивает возможность быстрой (5—15 мин) и нетрудоемкой диагностики непосредственно на месте отбора пробы [13]. Для документирования результатов ИХ и, при необходимости, их количественной оценки могут быть дополнительно использованы различные портативные средства видеорегистра-

ции — как специализированные, так и серийные (сканеры, мобильные телефоны) устройства [14].

На мировом рынке представлен широкий спектр иммунохроматографических тестов, позволяющих определять антитела к H. pylori в сыворотке крови, например фирм "ACON Laboratories", "Diagnostic Automation", "BD Diagnostic Systems", "Quidel" (США), "Cypress Diagnostics" (Бельгия), "Novamed" (Израэль), "Otsuka Pharmaceutical" (Япония), "Tsatsu Medical Services" (Индонезия) и антигены H. pylori в кале фирм "Immunospec" (США), "Standard Diagnostic" (Корея), "Coris BioConsept" (Бельгия), "CerTest Biotec" (Испания) и др. Сравнительная характеристика 22 коммерческих иммунохроматографических тест-систем для обнаружения антител к H. pylori и 14 тест-систем для обнаружения антигенов H. pylori, проведенная в работе [15], показала, что диагностическая чувствительность и специфичность тест-систем варьировали от 85 до 100%, время определения от 2 до 20 мин и стабильность при хранении от 12 до 24 мес. Однако описания процесса разработки иммунохроматографических тестов для обнаружения H. pylori в литературе практически не представлены, за исключением статьи C. Кара-куса [16], в которой рассматривается разработка иммунохроматографического теста для определения цитотоксина CagA, секретируемого клетками H. pylori.

Следует отметить, что для эффективной диагностики востребованы высокочувствительные методы детекции H. pylori. При работе с данным микроорганизмом не используется универсальный антигенный препарат, производители тест-систем ограничиваются сведениями о минимальной выявляемой концентрации препарата, используемого ими для получения градуировочной зависимости или контроля качества. Несмотря на отсутствие данных сравнительного испытания таких стандартов, оценка с их помощью возможностей иммунохимических методов достаточно информативна. Так, иммуноферментные тест-системы разных производителей ("Eagle Biosciences", США; "Diagnostic Automation", США; "Arigo Biolaboratories", Тайвань), реализованные с применением различных антител, обеспечивают пределы обнаружения антигенов H. pylori в диапазоне 3—50 нг/мл. Для коммерческих иммунохромато-графических тестов порог детекции, как правило, не указывается. В статье C. Каракуса [16] сообщается, что данная величина составляла 4 мкг/мл.

Учитывая, что по чувствительности иммуно-хроматографический анализ (ИХА), как правило, уступает ИФА [12], представлялось оправданным в рамках разработки иммунохроматографическо-го теста на антигены H. pylori охарактеризовать возможности снижения предела его обнаружения. С этой целью в работе был изучен подход, осно-

ванный на сочетании наночастиц золота (НЧЗ), как маркера иммунных комплексов и последующего усиления окрашивания зон связывания тест-полоски в присутствии солей серебра. Эффективность данного подхода показана в ряде работ. Так, в статье Л. Анфосси с соавт. [17] описывается снижение предела обнаружения охратоксина А в иммунохрома-тографическом анализе более, чем в 10 раз. C. Лиу с соавт. [18] отмечают, что усиление с помощью солей серебра обеспечило снижение предела иммунохро-матографического обнаружения возбудителей саль-монеллеза с 107 до 104 кл./мл. Использование дополнительных обработок с целью усиления окрашивания в тест-полосках для детекции H. pylori и соответствующего снижения предела обнаружения ранее не описывалось.

Цель работы — разработка и характеристика иммунохроматографической тест-системы, обеспечивающей высокочувствительное выявление антигенов H. pylori.

МЕТОДИКА

Реактивы. В работе использовали антигены AGHPY-0100 (Аг 0100), AGHPY-0103 (Аг 0103) и AGHPY-0104 (Аг 0104) H. pylori, мышиные моно-клональные антитела

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком