ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 48, № 6, с. 653-661
УДК 619:616.98
РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ
ДЛЯ ЭКСПРЕССНОЙ ДЕТЕКЦИИ ЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО АНТИГЕНА И КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
© 2012 г. Н. А. Вызова*, А. В. Жердев*, С. З. Ескеидирова**, К. К. Балтии**, Г. Б. Унышева**, К. К. Муканов**, Е. М. Раманкулов**, Б. Б. Дзаитиев*
*Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 119071, e-mail: nbyzova@inbi.ras.ru **Национальный центр биотехнологии РК, Астана, Казахстан, 010000 Поступила в редакцию 16.04.2012 г.
Разработан экспресс-метод детекции поверхностного липополисахаридного антигена и клеток возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота, представляющий собой иммунохроматографический анализ в "сэндвич"-формате. Контакт пробы и тест-полоски с нанесенными иммунореагентами инициирует движение жидкости по мембранным компонентам тест-полоски, иммунохимические взаимодействия и формирование окрашенных зон. Показано, что данный метод позволяет за 10 мин определять липополисахаридный антиген клеточной стенки возбудителя бруцеллеза в концентрациях до 10 нг/мл и клетки Brucella abortus в концентрациях до 106 кл./мл (5 х 104 кл. в пробе). Подтверждена специфичность иммунодетекции. Разработанная тест-система может быть использована при внелабораторной экспресс-диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота.
Во многих странах бруцеллез наносит значительный экономический ущерб, обусловленный заражением сельскохозяйственных животных и частыми случаями инфицирования людей [1, 2]. Высока актуальность этой проблемы, в частности, для России и Казахстана [3—6].
Одним из основных направлений в борьбе с бруцеллезом является своевременное выявление очагов инфекции, эффективность которого связана с достоверной, оперативной и информативной лабораторной диагностикой заболевания. Для диагностики бруцеллеза в настоящее время используют бактериологические, биологические, молекулярные и серологические методы, каждый из которых обладает своими достоинствами и ограничениями [7].
Бактериологический метод при положительном результате обеспечивает наиболее достоверную лабораторную диагностику бруцеллеза. Дополнительное преимущество метода заключается в возможности идентификации возбудителя до биовара, что позволяет установить источник инфекции и наметить наиболее эффективные противоэпидемические и профилактические мероприятия. Вместе с тем недостатками метода являются длительность получения результатов, трудоемкость и опасность для персонала, низкая производительность и другие факторы [7, 8].
Биологический метод основан на избирательном накоплении возбудителя бруцеллеза в организме восприимчивых к нему лабораторных животных при парентеральном введении исследуемого материала, в том числе загрязнен-
ного посторонней микрофлорой. Метод несколько более чувствителен, чем бактериологический, при работе с высоковирулентными штаммами бру-целл, но малопригоден при исследовании материала, содержащего возбудитель с ослабленной вирулентностью. В остальном биологический метод сохраняет недостатки бактериологического.
Для детекции и идентификации бруцелл и лабораторного подтверждения диагноза используют также метод полимеразной цепной реакции, позволяющий в течение 5—6 ч определить наличие специфической последовательности ДНК бруцелл в пробах [9]. К ограничениям метода следует отнести длительность, повышенные требования к условиям проведения лабораторного тестирования и квалификации персонала.
Серологические методы позволяют фиксировать наличие антигенсодержащего материала или антител к нему, не прибегая к изоляции болезнетворного агента. В отличие от бактериологического и биологического методов, достоверность которых вытекает из факта выделения бруцелл, серологические тесты представляют доказательства присутствия в исследуемом материале искомого агента на основе специфического взаимодействия антиген—антитело. Важным преимуществом этих методов перед первыми является возможность детекции не только корпускулярных, но и субкорпускулярных и растворимых антигенов (т.е. циркулирующих в организме или выводимых из него фрагментов возбудителя). К настоящему времени предложены и используются разнообразные серологические тесты, позволяю-
щие выявлять как антигены бруцелл, так и специфические антитела: реакция агглютинации [10, 11], реакция связывания комплемента [12], имму-нодиффузия [10], иммунофлуоресцентный анализ [13], иммуноэлектрофорез [14], радиоиммунный анализ [15], иммуноферментный анализ (ИФА) [16—18], дот-иммуноанализ [19]. Многообразие серологических методов обусловлено, главным образом, стремлением повысить их достоверность и информативность. Исходя из этого, обычно используют не один серологический тест, а несколько дополняющих друг друга тестов [20].
Выбор оптимального формата иммуноанализа основывается прежде всего на его экспрессности и пределе детекции. Исходя из этих критериев, несомненными преимуществами обладают активно разрабатываемые в последнее время имму-нохроматографические методы анализа [21]. При проведении иммунохроматографии контакт пробы с тест-полоской инициирует движение реагентов по мембранам тест-полоски и все происходящие при этом специфические реакции. Вызываемое окрашивание определенных зон тест-полоски позволяет сделать вывод о результатах тестирования, в том числе исходя из визуальной оценки интенсивности окрашивания. Таким образом, иммунохроматография обеспечивает возможность проведения быстрого (5—15 мин) и нетрудоемкого анализа, который может быть реализован непосредственно на месте отбора пробы [22]. Для документирования результатов иммуно-хроматографии и при необходимости их последующей количественной оценки могут быть дополнительно использованы различные портативные средства видеорегистрации — как специализированные устройства, так и серийные сканеры и мобильные телефоны [23, 24].
Цель исследования — разработка и характеристика экспрессного иммунохроматографическо-го анализа (ИХА) для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота (КРС), основанного на определении в биоматериале клеток возбудителя бруцеллеза Brucella abortus и его специфического антигена — липополисахарида (ЛПС) клеточной стенки.
МЕТОДИКА
Реактивы. В работе применяли антитела козы (GAMIss), кролика (RAMIss) и овцы (SAMIss) против IgG мыши и антитела овцы (SARIss) против IgG кролика ("Имтек", Россия), антитела козы (GAMI) против IgG мыши ("Arista Biologicals", США), конъюгат антител быка против IgG мыши с пероксидазой ("Медгамал", Россия), трис, Тритон Х-100, дигидрохлорид 3,3',5,5'-тетраметил-бензидина, N-гидроксисукцинимидный эфир биотина, цитрат натрия, азид натрия, фетальную сыворотку КРС ("Sigma", США), золотохлори-
стоводородную кислоту ("Fluka", Германия), ди-метилсульфоксид (ДМСО), Твин-20, БСА ("MP Biomedicals", Великобритания). Все вспомогательные реагенты (соли, кислоты, щелочи, органические растворители) были аналитической или химической чистоты.
Растворы для получения коллоидного золота (КЗ) и его конъюгатов готовили на деионизиро-ванной воде (18.2 Mfi cm при 25°С, система Simplicity, "Millipore", США).
ИФА проводили в 96-луночных прозрачных полистироловых микропланшетах Costar 9018 ("Corning Costar", США). Для изготовления им-мунохроматографических тест-полосок использовали наборы mdi Easypack ("Advanced Microdevices", Индия), включающие рабочую мембрану, закрепленную на твердой основе, подложку для коллоидного конъюгата, мембрану для нанесения пробы, конечную адсорбирующую мембрану и ламинирующую защитную пленку.
В работе также использовали коммерческий препарат единого бруцеллезного антигена Brucella abortus 19 производства НПО "Антиген" Алма-ты, Казахстан (концентрация клеток 1010 кл./мл).
Выращивание культуры клеток B. abortus 19.
Культуру клеток B. abortus 19 выращивали на эритрит-агаре при 37°С в течение 3—4 сут. Клетки смывали стерильным физиологическим раствором, рН 7.0—7.2, фильтровали и прогревали при 80°С в течение 1 ч для инактивации бруцелл. Для отделения бактериальной массы взвесь центрифугировали при 3000 g в течение 10—15 мин. На-досадочную жидкость отделяли, а осадок использовали для получения ЛПС клеточной стенки бруцелл.
Получение бактериальных препаратов. При характеристике специфичности тест-систем были использованы клетки B. suis, Yersinia enterocolitica O:9 R, O:9 S и 287, Francisella tularensis, Vibrio chol-erae Inaba, Salmonella enteritidisyena, S. typhimurium TA 100, Escherichia coli 565, E. coli 113-3, Shigella sonne, S. flexneri, Staphylococcus aureus, Citrobacter freundii в концентрациях 109—1010 кл./мл, подвергнутые термообработке при 80°С в течение 1 ч.
Выделение ЛПС антигена B. abortus. ЛПС бруцелл получали методом водно-фенольной экстракции. Инактивированную клеточную массу B. abortus 19 экстрагировали водно-фенольной смесью (объемное соотношение вода—фенол = 1 : 1) 15 мин при 70°С, после охлаждения центрифугировали при 1100 g в течение 1 ч. Отделяли феноль-ный слой, повторяли экстракцию в таком же режиме, объединяли фенольные фазы и диализова-ли их против воды. Содержание углеводов определяли фенольно-серным методом [25], а затем концентрировали препарат до 1 мг/мл. К полученному препарату антигена добавляли азид
натрия до конечной концентрации 0.1% и хранили при 2—4°С.
Получение моноклональных антител. Иммунизация включала 5 внутрибрюшинных инъекций препарата ЛПС B. abortus 54 мышам BALB/c (первая — в смеси с полным адъювантом Фрейнда и 4 последующих — в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7.4, с 0.1 М NaCl, ФБС). Дозы иммуногена на животное составляли 100 мкг. Титр специфических антител определяли методом ИФА. Для получения иммунных спленоцитов использовали мышей с максимальным титром.
Через 3 сут после последней иммунизации выделяли спленоциты и смешивали их с миеломными клетками линии X63-Ag-8.653. Селекцию гибридом проводили в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Для культивирования клеток использовали среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки плода КРС.
Начиная с 10 сут после слияния клеток, суп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.