научная статья по теме РАЗРАБОТКА ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ЛИПИД-САПОНИНОВОГО НОСИТЕЛЯ СУБЪЕДИНИЧНЫХ АНТИГЕНОВ НА ОСНОВЕ ГЛИКОЛИПИДА МОНОГАЛАКТОЗИЛДИАЦИЛГЛИЦЕРОЛА ИЗ МОРСКИХ МАКРОФИТОВ И ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ИЗ CUCUMARIA JAPONICA Биология

Текст научной статьи на тему «РАЗРАБОТКА ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ЛИПИД-САПОНИНОВОГО НОСИТЕЛЯ СУБЪЕДИНИЧНЫХ АНТИГЕНОВ НА ОСНОВЕ ГЛИКОЛИПИДА МОНОГАЛАКТОЗИЛДИАЦИЛГЛИЦЕРОЛА ИЗ МОРСКИХ МАКРОФИТОВ И ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ИЗ CUCUMARIA JAPONICA»

БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 5, с. 786-795

МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА

УДК 577.352 577.115 615.37

РАЗРАБОТКА ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ЛИПИД-САПОНИНОВОГО НОСИТЕЛЯ СУБЪЕДИНИЧНЫХ АНТИГЕНОВ НА ОСНОВЕ ГЛИКОЛИПИДА МОНОГАЛАКТОЗИЛДИАЦИЛГЛИЦЕР ОЛА ИЗ МОРСКИХ МАКРОФИТОВ И ТРИТЕРПЕНОВЫХ ГЛИКОЗИДОВ ИЗ Cucumaria japonica

© 2013 г. А.Н. Мазейка, Э.Я. Костецкий, Н.М. Санина, А.М. Попов*,

В.И. Калинин*, И.А. Ли

Дальневосточный государственный университет, 690000, Владивосток, ул. Октябрьская, 27;

*Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022, Владивосток, пр. 100лет Владивостоку, 159 E-mail: nikandrei@inbox.ru, kostetsky@nt.pin.dvgu.ru Поступила в p едакцию 05.05.10 г.

После последней доработки 04.02.13 г.

И сследована способность тритерпеновых гликозидов голотурий: голотоксина А1 из Apostichopus japonkus и суммы моносульфатированных гликозидов из ¿u^mana japonica - кукумариозида -к формированию надмолекулярных комплексов с холестерином, моногалактозилдиацилглице-ролом и фосфатидилхолином. C помощью просвечивающей электронной микроскопии показано, что в присутствии полярных мембранных липидов и холестерина исследованные гли-козиды формируют надмолекулярные липид-сапониновые комплексы, представляющие собой трубчатые частицы длинной 100-300 нм, наружным диаметром 10-16 нм и внутренним диаметром 2-6 нм. Показано, что в присутствии моногалактозилдиацилглицерола эффективно формируются трубчатые частицы с постоянным диаметром, четко выраженным внутренним каналом и ровными торцами, тогда как фосфатидилхолин оказался неспособен полностью входить в состав полученных комплексов. На основании электронно-микроскопических данных подобран диапазон оптимальных весовых соотношений моногалактозилдиацилглицерол-холе-стерин-кукумариозид (1-10:2:3), способствующий наиболее эффективному формированию комплекса. Исследованы различные способы введения модельных антигенов: гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа в составе субъединичной вакцины 1пДиуас и порина из Yersinia pseudotuberrnlosis в комплексы на основе моногалактозилдиацилглицерола, холестерина и кукумариозида. В зависимости от способа введения в состав липид-сапонинового комплекса встраивается от 54 до 72% вносимых антигенов вакцины 1пДиуас и 88-92% порина. Показано, что ультразвуковая обработка при введении в комплекс антигенов вакцины 1пДиуас приводит к потере данным антигеном функциональной активности. Встраивание порина приводило к увеличению диаметра трубочек, тогда как в присутствии антигенов вакцины 1пДиуас на торцах частиц формировались «шапочки». Доказано, что разработанный надмолекулярный липид-сапониновый комплекс моногалактозилдиацилглицерол-холестерин-кукумариозид может служить носителем бактериальных и вирусных субъединичных антигенов.

Ключевые слова: тритерпеновые гликозиды, холестерин, моногалктозилдиацилглицерол, фосфа-тидилхолин, вакцины, адъюванты, носитель антигенов, гемагглютинин, липид-сапониновые комплексы, голотоксин А кукумариозид А 2-2.

П рименение субъединичных антигенов в вакцинопрофилактике является одним из самых эффективных способов повышения безопасности и пр отективности совр еменных вакцин. Су-

Сокращения: ФХ - фосфатидилхолин, МГДГ - моногалак-тозилдиацилглицерол, Хол - холестерин, ГТА - голотоксин А^ КДА - кукумариозид А2-2, ГА - гемагглютинин.

щественные затруднения в разр аботке субъединичных вакцин связаны с низкой иммуноген-ностью высокоочищенных субъединичных антигенов, что делает необходимым применение в составе вакцин адъювантов. Из-за побочных эффектов лишь немногие из большого количества существующих адъювантов могут применяться в медицинских и ветеринарных вакцинах.

По этой причине разработка новых эффективных и безопасных адъювантов является актуальной задачей.

Механизм действия адъювантных носителей антигенов не вполне ясен и, вероятно, связан с созданием адекватной формы представления антигена иммунокомпетентным клеткам, в которой отдельные белковые молекулы собр аны в надмолекулярные ансамбли, сходные по структуре с мембранами нативных вирусов и бактерий. Наиболее эффективно эта стратегия реализована в иммуностимулирующих комплексах, способных многократно усиливать гуморальный иммунный ответ и стимулировать клеточный иммунитет [1]. Иммуностимулирующие комплексы, наряду с комплексами гликоалка-лоидов растений семейства пасленовых [2,3], могут быть отнесены к надмолекулярным ли-пид-сапониновым комплексам. Они представляют собой комплексы фосфатидилхолина (ФХ), холестерина (Хол), суммы тритерпеновых гли-козидов квиляйи мыльной (Quillaja saponaria) -QuilA и белкового антигена, образующие сферические частицы диаметр ом 40-100 нм. Существенный недостаток иммуностимулирующих комплексов - токсичность, обусловленная наличием сапонинов QuilA [4,5].

Нами была проведена сер ия работ с целью модифицир овать иммунологические свойства и снизить токсичность иммуностимулирующих комплексов. Известно, что гликоглицеролипи-ды морских макрофитов, в отличие от фосфо-липидов, обладают противовоспалительной [6], противоопухолевой [7] и противовирусной активностью [8], поэтому на первом этапе для модификации иммунологических свойств иммуностимулирующих комплексов мы заменили фосфолипиды в их составе на моногалактозил-диацилглицер ол (МГДГ) из морских макрофи-тов [9]. На следующем этапе мы предприняли попытку заменить основной структуроопреде-ляющий компонент иммуностимулирующего комплекса - сапонины QuilA - на тритерпено-вые гликозиды голотурий. Известно, что три-терпеновые глюкозиды голотурий в низких дозах обладают иммуностимулирующим [10] и адъювантными [11] свойствами, по своей способности формировать комплексы с холестерином они сходны с сапонинами QuilA и полностью теряют токсичность в присутствии холестерина [12]. По этим причинам тритерпеновые гликозиды голотурий являются перспективной заменой токсичным сапонинам QuilA в со ставе иммуностимулирующих комплексов. Для решения данной задачи ранее мы изучили формирование комплексов между тритерпеновыми гликозидами голотурий (кукумариозидом А2-2

(КДА), голотоксином А1; фрондозидом А, ку-кумариозидом Gj) и холестерином [13], что позволило выбрать голотоксин А1 (ГТА) (рис. 1а) [14] и кукумариозид А2-2 [15] в качестве перспективной замены сапонинам QuilA. Этот выбор основан на том, что в холестерин-сапониновых суспензиях данных гликозидов пр оис-ходило эффективное формир ование тубуляр ных наночастиц.

Цель настоящего исследования - получение надмолекулярного липид-сапонинового комплекса, способного нести субъединичные белковые антигены. В данной работе, в отличие от комплексов, описанных ранее [13], вместо чистого кукумариозида А2-2 была использована сумма моносульфатированных тритерпеновых гликозидов из Cucumaria japonica - кукумарио-зид, в со став котор ого входят в равном соотношении кукумар иозиды А2-2 и А 4-2 (рис. 1б,в) [16] или голотоксин А1 Кукумариозид также обладает иммуностимулирующей активностью, при этом его получение экономически более выгодно и позволит в перспективе получать разрабатываемый носитель в большом количестве. В качестве модельных антигенов использовали антигены вир уса гр иппа вакцины Influ-уас и порообразующий белок (порин) из Yersinia pseudotuberculosis.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Голотоксин А1 и сумма моносульфатиро-ванных тритерпеновых гликозидов, куда входят в р авном соотношении кукумариозиды А2-2 и А4-2 из голотурии Cucumaria japonica, получены в соответствии с методикой [16] и предоставлены лабораторией ТИБОХ ДВО РАН (зав. лаб. акад. РАН В.А. Стоник). Антигены вируса гриппа - гемагглютинин (ГА) и нейр аминидаза (НА) использованы в составе коммерческой субъединичной вакцины 1пйиуас (Solvay Phar-ma, The Netherlands). Для работы использовали 0,01 М фосфатно-солевой буфер рН 7,2 (137 мМ NaCl, 7,86 мМ Na2HPO4, 1,47 мМ KH2PO4, 2,65 мМ KCl). Термоденатурированный мономер пор ина выделен и предоставлен лабораторией молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН (зав. лаб. д.х.н. Т.Ф. Соловьева) в виде р аствора в фосфатно-солевом буфере с концентр ацией белка 1 мг/мл и 0,8% октилгликозида. Холестерин использован в виде коммерческого препарата фирмы Sigma, США.

МГДГ из зеленой водоросли Ulva fenestrata выделяли в соответствии с методикой [17]. Хро -матографически чистый МГДГ растворяли в хлороформе и хранили при -20°С в темной

ОН

P ис. 1. C тр уктур ные фор мулы гликозидов голотур ий: (а ) - голотоксин А1, (б) - кукумар иозид А 4-2, (в) -кукумар иозид А 2-2.

посуде. Яичный фо сфатидилхолин был выделен в соответствии с методикой [18].

Липид-сапониновые комплексы получали по модифицированному нами методу гидратации липидных пленок [19]: 5 мг МГДГ раствор яли в 1 мл хлор офор ма, 5 мг холестер ина р аство-р яли в 1 мл хлор офор ма, 4 мг кукумар иозида растворяли в 1 мл дистиллированной воды, 4 мг голотоксина А. р астворяли в 1 мл дистил-

лированной воды. Далее для получения комплекса МГДГ-холестерин-кукумариозид автоматической пипеткой отбир али 75 мкл ра створ а МГДГ и 25 мкл р аствор а холестер ина, упар и -вали до суха на ротор ном испар ителе пр и темпер атуре +60°С, к сухому остатку прибавляли 47 мкл р аствор а кукумар иозида, в смесь до -бавляли 453 мкл фо сфатно-солевого буфер а. Суспензию озвучивали 5 мин ультразвуковым дезинтегр атор ом УЗДН-2Т (Р о ссия) п р и частоте

22 кГц. Конечная концентрация липидов со -ставляла 1 мг в 1 мл суспензии. После обработки ультразвуком препарат оставляли при комнатной температуре на 2 ч. Комплексы с другим соотношением компонентов получали аналогичным образом.

Антигены вакцины 1пйиуас в фосфатно-со -левом буфере вводили в готовый липид-сапо-ниновый комплекс непосредственно после обработки ультразвуком. Полученную смесь интенсивно встряхивали в течение 1 мин и выдерживали 2 ч при комнатной темпер атуре.

Порин прибавляли к липидной пленке, образовавшейся после выпаривания растворов МГДГ и холестерина, приливали раствор ку-кумариозида и фосфатно-солевой буфер, так чтобы конечная концентр ация липидов МГДГ и холестерина со ставляла 1 мг/мл, обрабатывали ультразвуком и выдерживали 2 ч при комнатной тем

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком