СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2012, том 26, № 2, с. 117-123
_ ЗРИТЕЛЬНАЯ _
СИСТЕМA
УДК 612.8
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСЛОЯ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ИЗ КАДАВЕРНОГО ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ IN SITU ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ СВОЙСТВ ЛИПОФУСЦИНОВЫХ ГРАНУЛ
© 2012 г. П.М. Арбуханова1, С.А. Борзенок1, М.А. Яковлева2, Т.Б. Фельдман1,2, М.А. Островский1,2
1ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова 127486, Москва, Бескудниковский бульвар, дом 59А 2Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, РАН 119334, Москва, ул. Косыгина, 4 E-mail: feldman@sky.chph.ras.ru
Поступила в редакцию 09.12.2011 г.
Разработан метод получения монослоя клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) из када-верных глаз человека, имеющих подробное офтальмологическое описание.
При помощи флуоресцентного сканирующего конфокального микроскопа (Leica TCS SP5, Германия) проведён спектральный анализ липофусциновых гранул (ЛГ) в монослое этих клеток. Методом ВЭЖХ и флуоресцентной спектроскопии проведено хроматографическое исследование состава флуорофоров ЛГ и спектральные характеристики хлороформного экстракта из суспензии клеток РПЭ кадаверного глаза, из которого получен образец монослоя клеток РПЭ.
Разработанный метод сравнительного анализа флуоресцентных характеристик ЛГ в экспериментах in situ (монослой клеток РПЭ) и in vitro (хлороформный экстракт из ЛГ, выделенных из суспензии клеток РПЭ) позволяет перейти к исследованию донорского материала с визуально наблюдаемыми старческими и дегенеративными изменениями.
Ключевые слова: флуорофоры, липофусциновые гранулы, ретинальный пигментный эпителий, сетчатка, метод аутофлуоресценции глазного дна.
ВВЕДЕНИЕ
Неинвазивные методы диагностики глазного дна получают всё большее распространение в практической офтальмологии. Одним из таких методов является метод регистрации аутофлуоресценции (АФ) глазного дна, позволяющий проводить диагностику возрастных изменений и дегенеративных заболеваний сетчатки. АФ позволяет оценить состояние, сохранность и жизнеспособность комплекса РПЭ/сетчатка (Holz et al., 2007).
Одним из основных источников аутофлуоресценции глазного дна являются ЛГ в клетках РПЭ (Schmitz-Valckenberg et al., 2008). РПЭ представ-
ляет собой монослой уплощенных, интенсивно пигментированных клеток, плотно прилегающих друг к другу и имеющих гексагональную форму. В процессе старения и особенно при ряде дегенеративных заболеваний сетчатки в клетках РПЭ накапливаются ЛГ (так называемый «пигмент старости»). Гранулы эти представляют собой не что иное, как сильно флуоресцирующие обломки фагоцитированных клетками РПЭ наружных сегментов фоторецепторов. ЛГ накапливаются в результате неполной лизосомальной деградации этих обломков. Помимо флуоресценции ЛГ обладают способностью к фотоиндуцированной генерации активных форм кислорода, что опреде-
ляет их фототоксичность и связь усугубляющего действия света при дегенеративных изменениях сетчатки (Островский и др., 1992; Boulton et al., 1993; Островский, 2005).
В состав ЛГ входят до 10-12 флуорофоров (Eldred et al., 1988). Хлороформные экстракты из ЛГ, выделенные из РПЭ кадаверных глаз человека различного возраста, наряду с основными флуоро-форами - А2Е и изо-А2Е содержат значительное количество других флуорофоров, флуоресцирующих в более коротковолновой области спектра и вносящих соизмеримый или даже больший вклад во флуоресценцию этих хлороформных экстрактов (Яковлева и др., 2006; 2009; 2010).
Поскольку общую картину АФ глазного дна формируют более десятка флуорофоров ЛГ, являющихся производными полностью-транс-рети-наля - конечного продукта фотопревращения зрительного пигмента родопсина, то представляется принципиально важным определить состав флуо-рофоров и их спектральные характеристики при старении РПЭ и при патологии. При этом следует иметь в виду, что неокисленные формы флуоро-форов и их окисленные формы, накапливающиеся с возрастом и при патологии, поглощают свет и соответственно флуоресцируют в разных областях спектра: окисленные формы флуоресцируют в более коротковолновой области спектра (Яковлева и др., 2010; Sparrow et al., 2010).
Насущной задачей в этой связи является исследование флуоресцентных характеристик различных форм флуорофоров не только in vitro в хлороформных экстрактах из ЛГ, но и in situ, т.е. непосредственно в нативных клетках РПЭ, а в будущем, возможно, и in vivo при анализе картины АФ глазного дна в ходе старения и/или развития патологии.
Цель настоящей работы - разработать способ выделения и фиксации клеток РПЭ кадаверных (трупных) глаз человека с последующим проведением в этих клетках цитологического спектрального анализа ЛГ in situ при помощи конфокального сканирующего флуоресцентного микроскопа.
МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ МОНОСЛОЯ КЛЕТОК РЕТИНАЛЬНОГО
ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ ИЗ КАДАВЕРНОГО ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА
Для исследования флуоресцентных свойств ЛГ в клетках РПЭ в экспериментах in situ был разработан оригинальный способ получения монослоя клеток РПЭ из кадаверных глаз человека.
В настоящее время известны различные способы выделения клеток РПЭ (Магшо^ет et а1., 2002; Bindewa1d-Wittich et а1., 2006). В этих работах описаны методы, в которых клетки РПЭ выделяются в виде комплекса сетчатка/РПЭ/хориоидея, где вклад в суммарную картину флуоресценции могут вносить окружающие слой РПЭ клетки и ткани, или в виде суспензии клеток, что приводит к нарушению архитектоники слоя РПЭ. Однако в этих работах акцента на получение монослоя клеток РПЭ не делается. Предложенный нами способ выделения и фиксации клеток РПЭ из ка-даверных глаз человека позволяет выделять его в виде монослоя, что дает возможность исследовать степень накопления и флуоресцентные характеристики ЛГ непосредственно в клетках РПЭ, причём выделенных из различных участков глазного дна.
Получение образцов монослоя клеток РПЭ осуществляли следующим образом.
• Кадаверные глаза были получены Глазным тканевым банком ФГУ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова» от трупов-доноров из танатологических отделений Московского Бюро судебно-медицинской экспертизы на основании действующего Договора между Московским Бюро судебно-медицинской экспертизы и ФГУ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова», а также Договора о научном сотрудничестве между ИБХФ РАН и ФГУ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова».
• До начала подготовки лабораторных образцов из трупных глазных яблок проводили серологическую диагностику трупов-доноров на инфици-рованность вирусами ВИЧ 1/11, Гепатитов В и С, сифилиса, как наиболее опасных возбудителей заболеваний, представляющих потенциальную угрозу для персонала. Клинико-лабораторную диагностику указанных инфекций проводили в вирусологической лаборатории ФГУ «МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова» по образцам крови, поставляемым вместе с тканями глазных яблок от доноров-трупов. Инфицированный материал обеззараживали и утилизировали согласно требованиям СанПин (Санитарных Правил и Норм). Таким образом, образцы получали только из "чистого" донорского материала от серонегативных трупов. Анализ и скрининго-вый отбор трупного донорского материала проводили по клиническим, половым и возрастным признакам.
• После отбора экспериментального материала проводился тщательный визуальный осмотр каждого кадаверного глаза специалистом-офталь-
Рис. 1. Фотографии глазного дна кадаверного глаза без видимых патологий (донор № 16).
а - в присутствии сетчатки (стрелкой указан диск зрительного нерва); б - с удаленной сетчаткой: 1 - диск зрительного нерва, 2 - макулярная зона.
мологом для проведения постмортальной диагностики состояния глазного дна.
• Далее проводили выделение монослоя клеток РПЭ отдельно из каждого отобранного кадавер-ного глаза по нижеследующей методике.
У энуклеированного глазного яблока отсекали передний отрезок циркулярно в 2-3 мм от лимба с иридо-хрусталиковой диафрагмой, максимально иссекали и удаляли стекловидное тело до центральной зоны сетчатки. Образовавшийся глазной бокал заполняли 3-4 мл нейтрального 5%-ного раствора формалина и оставляли на 24 ч при комнатной температуре в герметично закрытом контейнере. Далее при помощи автоматической пипетки формалин максимально извлекали из полости глазного бокала, после чего содержимое бокала трехкратно промывали дистиллированной водой. После этого под увеличением х30 стерео-микроскопа микрохирургическими инструментами (ретинальным шпателем, ретинальными ножницами и цанговым микропинцетом) в области макулы иссекали поверхностные слои сетчатой оболочки до слоя РПЭ в диаметре 7-10 мм. Далее при помощи специального микрохирургического инструмента - расслаивателя, поступательными движениями строго по горизонтали отделяли монослой клеток РПЭ, который переносили на предметное стекло с одновременным капельным нанесением на его поверхность раствора антифей-да в количестве 700-1000 мкл. Раствор антифейда содержит в своем составе в объемных %: глицерина раствор - 50 %, диазабицикло[2.2.2]октана раствор - 2%, трис-буфер - 0,02 М, рН=7,4 - до 100%. Этот раствор препятствует разрушению
флуорофоров и их "выцветанию" при действии видимого света. Готовый образец монослоя клеток РПЭ накрывали покровным стеклом, после чего хранили в горизонтальном положении в герметично закрытых контейнерах с ватным шариком, обильно смоченным 0,5%-ным раствором формалина. Образцы в таком виде могут храниться в холодильнике при +4°С до 30 сут.
К каждому образцу прилагали заключение постмортального диагностирования состояния глазного дна, данное врачом-офтальмологом.
Приводим пример.
Донор №16, 22 года. Танатологический диагноз: кардиомиопатия. Энуклеация глаза через 9 ч после смерти.
Осмотр глазных яблок: тонус глаз сохранен, склера и роговица без рубцовых (послеоперационных) изменений, передняя камера средней глубины, цвет радужки серый, зрачок округлой формы, в просвете зрачка визуализируется прозрачный хрусталик.
Осмотр глазного дна правого глаза: сетчатая оболочка отечная (вследствие постмортальных изменений), визуал
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.