Биохимия
Кузнецова И.Г., аспирант Дубовик Н. С., аспирант Комаров Т.Н., аспирант Медведев Ю.В., кандидат фармацевтических наук
Меньшикова Л.А., аспирант Северин С. Е., доктор химических наук, зав. кафедрой
Шохин И. Е., кандидат фармацевтических наук
Ярушок Т.А., кандидат фармацевтических наук
(Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации)
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАНОРАЗМЕРНОЙ ПОЛИМЕРНОЙ ФОРМЫ РИФАБУТИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
Разработана методика определения рифабутина - противотуберкулезного антибактериального средства широкого спектра действия, в плазме крови крыс методом ВЭЖХ с фотодиодно-матричным детектором. Пробоподготовку проводили жидкость-жидкостной экстракцией. Методика валидирована по следующим параметрам: селективность, линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения и стабильность. Аналитический диапазон методики составил 0,1-25 мкг/мл рифабутина в плазме крови. Полученный аналитический диапазон позволяет применять разработанную методику для проведения доклинических исследований.
Ключевые слова: рифабутин, PLGA, ВЭЖХ.
DEVELOPMENT OF DETERMINING METHODS FOR NANOSIZED POLYMERIC
FORM OF RIFABUTIN IN PLASMA
The method of rifabutin determination - antituberculous antibiotic with a wide spectrum, in rat plasma was worked out by HPLC with photodiode detector. Sample preparation was carried out by liquid-liquid extraction. Technique was validated for the following parameters: selectivity, linearity, accuracy, precision, limit of quantification and stability. Analytical range was 0.1-25 ng/ml of rifabutin in plasma. The resulting analytical range allows using this technique for preclinical studies.
Keywords: rifabutin, PLGA, HPLC.
Введение
По данным статистики Всемирной организации здравоохранения, несмотря на то, что в последнее десятилетие темпы роста заболеваемости туберкулезом снизились, показатели распространенности инфекции остаются высокими [1]. Кроме того, в нашей стране практически половина всех повторно зарегистрированных случаев заболевания приходится на туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью [2]. Одним из противотуберкулезных препаратов, использующихся при лечении резистентных штаммах Mycobacterium tuberculosis, а также в терапии заболеваний, вызванных грамположительными (Staphylococcus spp. Clostridium spp.) и грамотрицательными (Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae) бактериями, является рифабутин. Основной бактерицидный эффект рифабутина обусловлен способностью ингибировать ДНК-зависимую РНК-полимеразу бактериальных клеток, связываясь с Р-субъединицей фермента и препятствовать
инициации транскрипции. Важность и широта применения рифабутина подтверждается его включением Правительством РФ в «Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов» на 2013 и 2014 г [3].
Ограничивающими применение рифабутина факторами являются его малая растворимость и низкая биодоступность при пероральном приеме [4]. Преодолеть существующие недостатки становится возможным благодаря включению препарата в наноразмерную транспортную систему на основе биодеградируемых полимеров [5]. Это также обеспечит внутриклеточную доставку препарата, что важно в случае лечения туберкулеза, поскольку возбудитель локализован в фагосоме макрофагов.
Исходя из вышесказанного, существует необходимость в разработке методики количественного определения рифабутина в плазме крови с целью проведения дальнейших исследований по биораспределению рифабутина и его наноразмерных лекарственных форм.
Среди опубликованных данных о количественном определении рифабутина в плазме крови крыс приведены методы жидкостной хроматографии с УФ-детектором или диодно-матричным детектором (аналитический диапазон методик составил 10-7000 нг/мл [6]) и жидкостной хроматографии с масс-селективным детектированием (предел количественного обнаружения для рифабутина - 60 нг/мл [7]. На основании используемых терапевтических концентраций рифабутина и приведенных в литературе аналитических диапазонов методов позволительно считать эти диапазоны подходящими для фармакокинетических исследований рифабутина.
Материалы и методы
Хроматографический анализ образцов проводили на жидкостном хроматографе Agilent серии 1200 Infinity с фотодиодноматричным детектором (Agilent Technologies, США), оснащённым бинарным насосом, автосамплером, термостатом колонок. Данные обрабатывали при помощи программного обеспечения ChemStation (Agilent Technologies, США).
Для пробоподготовки использовали шейкер типа "вортекс" Heidolph Reax Top (Германия), испаритель под током азота Thermo Reacti-Therm (США), шейкер "Biosan" (Латвия), центрифугу Thermo Scientific SL16, ЕС; взятие навески осуществляли с помощью весов A&D GR-200 (Япония); реактивы и биоматериал по объёму дозировали с помощью дозаторов Ленпипет Лайт 100-1000, 20-200 и 10-100 мкл.
В работе использовали следующие реактивы: субстанция рифабутина (Taizhou Tianrui Chempharm Co., Ltd.); метанол (gradient grade, Scharlau); бутилгидрокситолуол (х.ч. Scharlau), ацетонитрил (Scharlau), гексан (Scharlau), этилацетат (Scharlau), воду очищенную.
Образцы нативной и исследуемой плазмы хранили в морозильнике при температуре от -45 до -50 °С. Стандартные растворы хранили в фармацевтическом холодильнике при температуре от 2 до 8 °С. Исходный раствор рифабутина готовили путем растворения навески стандарта в метаноле. Рабочие стандартные растворы готовили путем разведения исходного стандартного раствора метанолом.
Подготовка плазмы крови к анализу осуществлялась жидкость-жидкостной экстракцией в смесь гексан: этилацетат (80:20). Для проведения пробоподготовки к 500 мкл плазмы крови прибавляли 2,5 мл смеси гексан: этилацетат (80:20), перемешивали на вортексе в течение 30 секунд и затем центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. Органический слой отделяли. Процедуру экстракции повторяли еще раз. Органический слой переносили в пробирки для испарителя и упаривали под током азота при 43 °С досуха. Получившийся сухой остаток перерастворяли в 100 мкл ацетонитрила и переносили надосадочную жидкость в хроматогра-фические пробирки [6].
Хроматографическое разделение проводили на хроматографической колонке Zorbax Eclipse Plus C18 4,6х150 мм, 5 мкм с предколонкой Zorbax Eclipse Plus C18 4,6х12,5 мм, 5 мкм при 40 °С.
В качестве подвижной фазы использовали 0,05М ацетатный буферный раствор рН 4,5 - аце-тонитрил 52:48 Скорость потока подвижной фазы 1 мл/мин; объем вводимой пробы 5 мкл. Детектировали при длине волны 278±4 нм с записью спектра в диапазоне 200-400 нм. Время хро-матографирования одной пробы составило 10 мин; время выхода рифабутина - около 6,3 мин.
Результаты и обсуждение
Валидацию методики определения рифабутина в плазме крови проводили на основании руководства по валидации биоаналитических методик FDA [8,9], а также Руководству по экспертизе лекарственных средств под ред. проф. А. Н. Миронова (ФГБУ «НЦ ЭСМП», 2013) [10].
Селективность
Анализировали 6 образцов чистой плазмы, образцы чистой плазмы с добавлением стандартных растворов рифабутина в концентрациях 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2,5; 10 мкг/мл. На хромато-граммах образцов чистой плазмы не наблюдалось пиков со временем удерживания, соответствующим времени удерживания рифабутина (рисунок 1).
triAU -- с I
з- £ ас
6 - Й
4 - |[
2 - I 1
0 - v \ - 1.1
-|-П г г , , [■; Ч | i ii ' Г П ' Г :) О ' ГП Т U 1 ? : ? р—
1 2 3 4 5 6 7 i
Рис. 1. Хроматограмма нативной плазмы с добавлением стандартного раствора рифабутина
(1 мкг/мл)
Линейность
Линейность методики оценивалась по 5 калибровочным стандартам (0,1; 0,5; 1; 2,5; 10 мкг/мл). В изучаемом диапазоне концентраций (С) отмечена линейная зависимость между концентрацией анализируемого соединения и соответствующей площадью пика. По полученным значениям построен калибровочный график, коэффициент корреляции составил 0.99991 (рисунок 2).
Аггюипт[ткс|/т1]
Рис. 2. Калибровочный график зависимости площади пикарифабутина от его концентрации в плазме.
Отклонения концентраций калибровочных растворов для первой точки составило не более 20% и не более 15% для последующих точек.
Правильность и прецизионность
Для оценки правильности для всех растворов, проанализированных в ходе установления линейности, рассчитывали величины степени экстракции (%) и относительной погрешности (в, %) по формулам:
1. степень экстракции = 100-Сизм
с;
2. в = 100-(С изм - Стеор)
Стеор
теор
3. Сизм ^ 1=1 С -П-
где Сизм - среднее значение измеренного количества рифабутина, рассчитанное по трем повторениям (мкг/мл), Стеор - внесенное количество рифабутина (мкг/мл), С1 - количество рифабутина, рассчитанное по уравнению линейной регрессии.
Также рассчиывали величину относительного стандартного отклонения значений измеренной концентрации аналита (Я8Б, %) [11].
Полученные результаты представлены в таблице
Таблица.
Правильность и прецизионность методики
Внесенное ко- Измеренное Среднее значение 8Б степень экс- £, % Я8Б, %
личество, количество, измеренного ко- (п=3) тракции, %
мкг/мл мкг/мл личества, мкг/мл
0,102
0,1 0,101 0,101 0,001 101 0,92 1,0
0,100
0,47
0,5 0,49 0,47 0,02 94 -6 4,26
0,45
0,99
1 1,02 0,99 0,03 99 -1 3,03
0,96
2,52
2,5 2,49 2,487 0,03 99,48 -0,52 1,41
2,45
10,19
10 10,03 10,01 0,19 100,1 0,1 1,91
9,81
Предел количественного определения
Пределом количественного определения методики минимальное количество рифабути-на, которое может быть количественно определено с помощью данной методики. ПКО методики составил 0,1 мкг/мл.
Заключение
Разработана методика количественного определения рифабутина в плазме крови крыс методом ВЭЖХ с применением отодиодноматричного детектора при длине волны 278±4 нм. Данная методика обладает достаточной чувствительностью, точностью и селективностью для определения концентраций препаратов в плазме крови. Методика была валидирована по основным параметрам в соответствии
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.