ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 5, с. 356-359
= РЕГЕНЕРАЦИЯ
УДК 616.316:591.169.2
РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МИТОГЕНОВ, ЗАПУСКАЮЩИХ РЕАКТИВНУЮ ГИПЕРПЛАЗИЮ В ЭПИТЕЛИИ РОГОВИЦЫ, ПОСЛЕ ТРАВМЫ БОЛЬШОЙ СЛЮННОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2004 г. А. Б. Денисов
Московский государственный медико-стоматологический университет 103473 Москва, ул. Делегатская, д. 20/1
Поступила в редакцию 25.06.03 г. Окончательный вариант получен 04.03.04 г.
В работе на 132 крысах после сиалотомии обнаружено неспецифическое усиление пролиферации клеток в эпителии роговицы. Выявленный эффект, вероятно, связан с дистанционным характером действия факторов, стимулирующих пролиферацию клеток. Данный феномен может быть использован для выявления митогенов, образующихся при регенерации слюнных желез.
Ключевые слова: митогены, эпителий роговицы, модель, регенерация, слюнные железы.
Слюнные железы человека и животных относятся к тканям со слабой регенераторной потенцией. Возникающая компенсаторная посттравматическая гиперплазия не обеспечивает восстановление утраченных клеток и не приводит к полноценной адаптации (Бабаева, 1987).
Поиск методов стимуляции пока малоуспешен. Нам представляется, что это во многом связано с неадекватным акцентом в исследованиях на поиск только тканеспецифических стимуляторов регенерации. Любой орган состоит не только из совокупности специализированных клеток, но и включает в себя клетки соединительной и нервной ткани, кровеносные и лимфатические сосуды. Поэтому действие всех возможных стимуляторов пролиферации клеток не является моноспецифическим.
Вопрос о неспецифическом влиянии травмы слюнных желез и других органов на начальных стадиях восстановления на процесс пролиферации клеток в организме исследован плохо. Причины и механизмы посттравматической регенерации (ПТР) больших слюнных желез (БСЖ) изучены недостаточно. По нашим данным и данных других авторов, локальная травма слюнных желез (СЖ) приводит к усилению в них темпов пролиферации клеток в три-пять раз, причем не только в области, прилежащей к поврежденной ткани, а по всей массе этой железы и даже в интактной, контралатеральной (Красильникова, 1962; Алов, 1964; Порадовская, 1971; Бабаева, Шубникова, 1979; Гусак, 1980; Денисов,1981). В подчелюстной слюнной железе (ПЧСЖ) крысы после сиалотомии (резекции ее на треть) усиление пролиферации максимально на 2-3-и сут.
Через неделю после травмы пролиферация в аци-нарной ткани снижалась до нормы.
Для объяснения посттравматического усиления пролиферации была использована теория так называемых "раневых факторов", согласно которой главной причиной гиперплазии являются продукты раневого распада (Алов, 1964; Карлсон, 1986) Но выделить эти вещества в чистом виде не удалось, так как это связано с рядом методических трудностей. Для выделения и изучения "раневых" факторов, в том числе и из СЖ, использовали следующую схему. Интактным животным вводили экстракты из тканей или сыворотку крови от животных, подвергнутых травме. Если в гомологичном органе или ткани происходило усиление пролиферации, делался вывод о присутствии в исследуемом препарате регенера-ционных митогенов (Конышев, 1974).
В настоящее время эта модель для обнаружения регуляторов пролиферации не вполне удовлетворяет существующим представлениям о иерархической регуляции пролиферации с помощью внутриклеточных, короткодистантных и надклеточных факторов (Серов, Шехтер, 1981), так как не позволяет отделить эффекты действия одних факторов от других. Схема поиска методически устарела, потому что, во-первых, митоген-ные эффекты часто связаны с загрязнением препаратов известными факторами роста - эпидер-мальным (EGF) и тромбоцитарным (PDGF) (Ross et al., 1979). Во-вторых, для выделения высоко-очищенного препарата в физических количествах (мг), необходимо не менее 50 кг ткани или 10000 л крови (Wissler, 1982). В-третьих, моделирование запуска посттравматической гиперпла-
Рис. 1. Влияние введения различных сывороток от крыс с сиалотомией на пролиферацию клеток в эпителии роговицы. По оси абсцисс - группы животных; по оси ординат - митотический индекс в эпителии роговицы, %%. Число исследованных животных во всех группах - 10.
Введение: 1 - физиологического раствора, 2 - сыворотки от контрольных животных, 3 - сыворотки от животных через 24 ч после сиалотомии, 4 - сыворотки от животных через 48 ч после операции.
зии на интактных органах и тканях неадекватно изучаемому процессу, так как при травме органов повреждаются не только клетки, но и их иннервация и микроциркуляция.
Учитывая вышеизложенное, мы разработали новую модель для поиска и количественной оценки только надклеточных регуляторов пролиферации, которая лишена указанных недостатков. При разработке модели использовали теорию информации (Девятков и др., 1982; Конышев, 1980), согласно которой травмированный орган следует считать источником сигналов информации, так как в результате образуются факторы, влияющие на пролиферацию. Эта информация поступает в кровь - канал связи. В качестве критерия действия секретируемых факторов (приемника информации), которые могут быть как активаторами так и ингибиторами, можно использовать показатели величины пролиферации в неповрежденных тканях, не имеющих общей иннервации с травмированным органом, чтобы исключить перкуссионные изменения в пролиферации через нервные пути. Следует отметить, что все известные надклеточные регуляторы пролиферации не являются моноспецифическими (Ба-лаж, Блажек, 1982). Поэтому мы выбрали в качестве тест-объекта эпителий роговицы (ЭР), в котором хорошо изучены все показатели пролиферации и ее изменения позволяют надежно регистрировать появление в крови (канале связи) регуляторов пролиферации (Денисов, 1983).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Были проведены три серии опытов на 132 нелинейных белых самках крыс. Техника сиалотомии описана ранее (Денисов,1983), методика изучения митотической активности в тотальных препаратах ЭР тоже описана (Денисов, 1973). В первой серии опытов (40 крыс) интактным животным внутривенно вводили 0.5 мл сыворотки крови от животных через 24 и 48 ч после сиалотомии. В качестве контроля служила кровь животных, не подвергавшихся операции. Во второй серии опытов (34 крысы) изучали пролиферацию клеток в ЭР на 3-и сут после сиалотомии правой ПЧСЖ. Для этого вычисляли статмокинетичес-кий индекс (число митозов и к-метафаз) в % в ЭР (МИкх), за 3 ч до забоя вводя животным колхицин в дозе 1 мг/кг.
В третьей серии опытов (34 крысы 2-й серии + 58) изучали динамику пролиферации клеток через 114 сут после правосторонней сиалотомии. Достоверность определяли по ¿-критерию Стьюдента и ^-критерию Фишера (Гланц,1998). Результаты считали достоверными при р < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты исследований представлены на рис. 1. Обработка данных методом дисперсионного анализа выявила достоверные изменения пролиферации клеток ЭР под влиянием сыворотки от животных с ПТР ПЧСЖ (^ = 3.54; р < 0.05). Более сильным митогенным эффектом обладает сыворотка, взятая через 48 ч после травмы (148 ± 20%, р < 0.01). Полученные результаты подтверждают,
358
ДЕНИСОВ
Рис. 2. Пролиферация в эпителии роговицы на 3-й сут после сиалотомии. По оси абсцисс - номер опыта (□ - опыт, □ - контроль), по оси ординат - митотический индекс, %%.
ется. Полученные результаты представлены на рис. 2.
Как и предполагалось, под влиянием сиалотомии пролиферация в ЭР увеличилась. Несмотря на высокую вариабельность (коэффициент вариации колеблется от 18 до 44%), во всех опытах получены сходные результаты: величина МИ возросла в интервале 155 ± 240%.
Доказав факт образования митогенов в результате сиалотомии, в третьей серии опытов мы определяли динамику изменения величины МИ в различные сроки после операции. Для того чтобы полнее определить направленность изменения величины пролиферации, были взяты следующие сроки забоя - 1 и 2 сут. Величина пролиферации в этот период (более короткий, чем длительность митотического цикла) свидетельствует об общем гуморальном пролиферативном потенциале - соотношении в крови стимуляторов и ингибиторов. Сиалотомия как экстремальный фактор вызывает развитие, во-первых, стрессовой реакции, для которой характерно увеличение в крови кортико-стероидов и катехоламинов - ингибиторов пролиферации клеток; во-вторых, острого воспаления с образованием гистамина - стимулятора пролиферации.
Как видно из рис. 3, в 1-е сут после сиалотомии в крови преобладают ингибиторы пролиферации, поэтому МИ снижен. Затем, на 2-3-и и особенно на 4-е сут эксперимента в ответ на появление в крови митогенов из СЖ развивается выраженная активация пролиферации. К концу первой недели пролиферация в ЭР, наоборот, ослабевает, а затем вновь к 11-м сут незначительно усиливается. Через две недели эксперимента пролифератив-ная реакция клеток ЭР в ответ на травму отсутствует. Иначе говоря, полученные нами результаты представляют кривую затухающего колебатель-
что в крови после травмы появляются митогены (Карлсон, 1986).
В следующей серии опытов была изучена пролиферация в ЭР после сиалотомии правой ПЧСЖ. Проведено четыре идентичных опыта на 34 крысах: у животных под наркозом резецировали около 20% массы СЖ. Затем через 3 сут (время продолжительности митотического цикла) удаляли глаза и по описанной методике изготавливали тотальные препараты ЭР, в которых оценивали уровень пролиферации. Для большей точности был использован метод накопления митозов с помощью колхицина. Доза колхицина не вызвала препрофазного торможения митозов и полностью блокировала метафазы (количество ана- и телофаз менее 1%). Схема эксперимента состояла в следующем. Если после сиалотомии в крови появляются митогены, то через время, соответствующее длительности митотического цикла в клетках ЭР, величина пролиферации увеличива-
Рис. 3. Динамика изменения пролиферации в эпителии роговицы после односторонней сиалотомии. По оси абсцисс - время забоя, сут; по оси ординат -митотический индекс, % к контролю.
ного процесса, т.е. состояние гуморальной регуляции в крови (канале связи) представляет собой саморегулирующийся с помощью ритмических колеб
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.