щие сборку микротрубочек веретена деления (Rieder, Palazzo, 1992).
Цель нашего исследования - разработка экспериментальной модели синхронизации митоти-ческих циклов цитостатиками, позволяющей видоизменять и контролировать композицию клеточных популяций эмбрионов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили зародыши Danio rerio. Половозрелых особей (самцов и самок раздельно) содержали при постоянной температуре +24°С и световом режиме: свет - 13 ч, темнота - 11 ч. За 12 ч до нереста по одной самке с двумя-тремя самцами отсаживали в отдельные садки и поднимали температуру до +28°. Развивающиеся яйца нужных стадий (от 512 клеток до 75%-ного обрастания) отбирали из нерестовых садков непосредственно перед началом эксперимента. При определении стадий развития руководствовались таблицами Киммела с соавторами (Kimmel et al., 1995).
Для ингибирования митозов использовали растворы синтетического антитубулинового агента -нокодазола ("Sigma", США) в концентрациях 0.5; 1.0; 2.0; 3.0; 5.0 и 10.0 мкг/мл. Нокодазол препятствует сборке микротрубочек в результате связывания с тубулиновыми димерами. Подавление формирования веретена приводит к аномальному поведению хромосом, т.е. к К-митозу. Выбор нокодазола был продиктован в первую очередь его относительно малой токсичностью (De Brabander et al., 1976; Kato, Tsunoda, 1992) и высокой специфичностью в отношении микротрубочек митоти-ческого веретена (Ates, Sentein, 1981). Было показано (Baumann, Sander, 1984; Strahle, Jesuthasan, 1993; Solnica-Krezel, Driever, 1994), что колцемид и нокодазол способны проникать в ткани зародышей костистых рыб через хорион яйца и плотно расположенные клетки перидермы, однако вопрос о скорости удаления этих антиметаболитов из яйца при отмывке по существу не исследовался. Учитывая это обстоятельство, были поставлены две серии опытов. В первой экспериментальным манипуляциям подвергали зародыши, развивающиеся в яйцевых оболочках; во второй проводили ферментативную дехорионизацию. Материал инкубировали в пластиковых чашках Петри (5 мл) в среде с проназой XXIII ("Sigma", США) с активностью 4 ед/мг в концентрациях 2, 4, 10 и 20 мг/мл на двойном растворе Гольтфретера. Время, за которое зародыши освобождаются от оболочек, зависит от концентрации проназы. Из всех протестированных предпочтение было отдано раствору с концентрацией 4 мг/мл, в котором при температуре 26-28°С от оболочек за 6-8 мин освобождалось до 70-80% зародышей. Для оценки возможного влияния ферментативной обработки на эмбриогенез проводили прижизненные наблюдения за развитием дехори-
онизированных и интактных зародышей, а также их гистологический анализ. В качестве критериев сравнения служили: скорость эпиболии и сегментации, формирование глазного бокала, образование железы вылупления, начало сокращений сердца, образование форменных элементов крови, начало локомо-ции зародышей и ее интенсивность, пространственно-временной паттерн пигментации. Ни по одному из вышеперечисленных параметров зародыши из двух сравниваемых групп не отличались. После освобождения зародышей от оболочек производили пятикратную отмывку двойным раствором Гольтфретера. Зародыши в оболочках и дехорионизированный материал делили на две группы (опытную и контрольную).
В обеих сериях экспериментов зародыши инкубировали в растворах митостатика 30 или 60 мин. По окончании экспозиции производили пятикратную (или более) отмывку от нокодазола либо фильтрованной аквариумной водой (серия I), либо раствором Гольтфретера на 0.05%-ном ДМСО с интервалами в 5 мин (серия II). Как было установлено (Katow, 1983), ДМСО в разведениях 0.1-0.01% не влияет на развитие ранних зародышей Danio rerio. После 5-кратной смены зародыши инкубировали в этой среде до конца эксперимента.
Материал фиксировали жидкостью Буэна (по 5-10 зародышей на стадию), заливали в парафин и готовили серийные срезы толщиной 6 мкм. На препаратах, окрашенных гематоксилином Бёмера, Майера и триоксигематеином (для контрастного окрашивания митотического веретена), подсчитывали митозы, а также атипические митотические фигуры и пикнозы. Для оценки возможного влияния нокодазола на прохождение клетками митотического цикла определяли относительное число профаз. Подсчет производили на каждом втором срезе преимущественно в области зародышевого щитка на ранних стадиях или в нейральном зачатке на стадиях после завершения эпиболии. Полученные значения выражали в процентах от общего количества клеток. Данные были подвергнуты компьютерному анализу с использованием пакета программ вариационной статистики "Microcal Origin 6".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Серия I. Эксперименты с зародышами в яйцевых оболочках. В первом эксперименте этой серии (рис. 1) воздействию нокодазола подвергали зародыши на стадии 512 клеток по завершении 10-го клеточного цикла, т.е. первого цикла, характеризующегося асинхронностью клеточных делений (Kane, Kimmel, 1993).
Первые блокированные митозы при 30-минутной обработке раствором нокодазола в разведении 1 мкг/мл отмечены в этом опыте только через 40 мин после его начала, т.е. через 10 мин после начала отмывки. При этом, однако, полного блока не происходит, поскольку на протяжении всего
0 10 и
О
О
отмывка
и
Основной эксперимент
30
3
I I
60 мин
отмывка
4>р 0 10 30
| | фиксации
Контроль на влияние ДМСО
60 мин
| фиксации Физиологический контроль
3 5
3 5
=>
6 ч
6 ч
0 10
30
60 мин
2
фиксации
35
=>
6 ч
Рис. 1. Схема эксперимента 1, серия I (стадия 512 клеток, обработка нонадазолом в концентрации 1 мкг/мл в течение 30 мин). Момент погружения в раствор: нокодазола ( ), ДМСО ( ); ( ) - начало отмывки; (^)-вре-
мя фиксации материала.
эксперимента наряду с блокированными встречаются и митозы с веретеном (табл. 1). Длительная задержка появления блокированных метафаз, по-видимому, обусловлена низкой концентрацией поступившего в зародыш митостатика. Чистое время ингибирования клеточного цикла (время от момента появления первых блокированных митозов до последней регистрации их в эксперименте) составляет 1 ч 10 мин, что на 40 мин больше пребывания зародышей в растворе нокодазола (табл. 1). Таким образом, в данном случае имеет место своеобразная "инерция блока".
В других экспериментах этой серии обработке подвергали зародыши на стадиях зародышевого щитка (6 ч после оплодотворения). Эта стадия были выбрана потому, что композиция слоя внутренних клеток бластодермы в это время характеризуется полной асинхронностью, что позволяет с большей достоверностью регистрировать наведенную синхронизацию клеток.
Во втором эксперименте использовали раствор нокодазола в концентрации 10 мкг/мл. Отмывку в
Таблица 1. Присутствие блокированных митозов в разные сроки после культивирования интактных зародышей в растворе нокодазола (1 мкг/мл) в течение 30 мин
Сроки экспери- Митозы Интерфазные
мента, мин К нормальные ядра
30 - + +
40 + + +
110 + + +
165 - + +
345 - + +
аквариумной воде с добавкой ДМСО проводили через 1 ч после начала экспозиции. Блокированные ме-тафазы в этом опыте отмечены через 10 мин после помещения материала в активную среду; с этого же момента в бластодерме не обнаруживали нормальные митозы (кроме профаз). Очевидно, концентрация нокодазола в этом случае достаточна для остановки движения клеток по циклу. Час-тые фиксации зародышей на протяжении опыта дали возможность определить динамику нарастания количества блокированных митозов, ее описывает типичная кумулята (рис. 2, а). Судя по продолжающемуся после начала отмывки нарастанию количества К-митозов, в этом случае также имеет место "инерция блока". Через 3-3.5 ч кривая выходит на плато, доля К-митозов при этом достигает почти 100%. Важно отметить, что в течение всего эксперимента (4 ч ) не обнаружено никаких признаков выхода клеток из блокированного состояния.
Угол наклона кривой К-митозов, по-видимому, отражает истинную скорость движения клеток по митотическому циклу, на которую не влияет предпринятая обработка митостатиком. Об этом свидетельствует и динамика доли профаз у зародышей изученных стадий, практически совпадающая в контроле и опыте (рис. 2, б).
Нокодазол при концентрации в среде 10 мкг/мл сохраняется в зародыше, окруженном оболочками, несмотря на отмывку. Присутствие митостатика в клетках зародыша в течение длительного времени обусловливает невозможность деконденсации хроматина. Обратимость митостатического блока в этих условиях не достигается, но обнаруживается пикнотическое перерождение клеток, приводящее
Рис. 2. Накопление К-метафаз (1) и изменение митотического индекса (физиологический контроль) (2) у зародышей на стадии зародышевого щитка, обработанных в течение 1 ч 10 мкг/мл нокодазола (а). Изменение доли профаз у экспериментальных (1) и контрольных (2) зародышей (6).
По оси абсцисс - продолжительность эксперимента, мин; по оси ординат - индекс К-митозов и митотический индекс (а) или индекс профаз (•), %.
Здесь и далее: ( ) - начало отмывки от митостатика; вертикальные линии - ошибка среднего.
их к гибели, о чем свидетельствуют повсеместные очаги некрозов. Существенную роль при этом играет, по-видимому, не только высокая концентрация митостатика, но и длительность экспозиции.
Третий эксперимент аналогичен второму, но наблюдения за опытными и контрольными зародышами, а также выборочные фиксации проводили в течение 2 сут. К тому времени, когда у контрольных эмбрионов полностью завершилась эпи-болия, обработанные зародыши демонстрировали лишь 75% обрастания, в дальнейшем полного покрытия желтка бластодермой так и не происходило, и, хотя перибласт замыкался по всей поверхности, развитие прекращалось и эмбрионы гибли. Эти наблюдения хорошо согласуются с результатами работ (Strahle, Jesuthasan, 1993; Solnica-Krezel, Driever, 994), в которых описаны задержка начала и замедление (а иногда и полное подавление) процесса эпиболии у эмбрионов Danio rerio после обработки нокодазолом. При обработке колцеми-дом в высоких концентрациях зародышей Danio rerio более ранних стадий (Baumann, Sander, 1984) были получены аналогичные результаты. У ранних куриных зародыш
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.