УДК 547.979.733
РАЗРАБОТКА НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ИК-ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРОВ НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ БАКТЕРИОХЛОРОФИЛЛА а И НАНОЧАСТИЦ ЗОЛОТА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ РАКА
© 2015 И.В. Пантюшенко1, П.Г. Рудаковская2,3, А.В. Старовойтова4, А.Л. Михайловская4, М.А. Абакумов5, М.А. Каплан4, А.А. Цыганков6, А.Г. Мажуга23, М.А. Грин1*, А.Ф. Миронов1
1 Московский государственный университет тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова, 119573 Москва; электронная почта: michael_grin@mail.ru
2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова,
химический факультет, 119991 Москва; электронная почта: alexander.majouga@gmail.com
3 Национальный исследовательский технологический университет
«МИСиС», лаборатория биомедицинских наноматериалов, 119991 Москва
4 Медицинский радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба, филиал ФМИЦ им. П.А. Герцена Минздрава России, 249036 Обнинск Калужской обл.; электронная почта: kaplan@mrrc.obninsk.ru 5 Российский национальный исследовательский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 117997 Москва; электронная почта: abakumov88@gmail.com
6 Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290 Пущино Московской обл.; электронная почта: ttt-01@rambler.ru
Поступила в редакцию 05.02.15 После доработки 07.03.15
Получено новое серосодержащее производное бактериохлорофилла а. Последний был выделен из биомассы несерных пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus штамм В10. Предлагаемый фотосенсибилизатор представляет собой #-аминобактериопурпуринимид, экзоциклическая аминогруппа которого ацилирована остатком липоевой кислоты, являющейся биогенным соединением, выполняющим в организме функцию кофактора пируватдегидрогеназного и а-кетоглутаратдегидрогеназного комплексов. Благодаря наличию дисульфидной группировки в молекуле липоевой кислоты, пигмент приобрел аурофильные свойства и был иммобилизован на поверхности наночастиц золота (НЧ-Аи) за счет образования связей 8-Аи. Форма и размеры полученных частиц с иммобилизованным фотосенсибилизатором (ФС-Аи) определены методами динамического светорассеяния (ДСР) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Наноструктури-рованный ФС представляет собой сферы с гидродинамическим диаметром 100—110 нм, поглощает свет в области 824 нм и интенсивно флуоресцирует при 830 нм, что позволило изучить кинетику его распределения в органах, здоровых и опухолевых тканях у животных — опухоленосителей. Сравнение биологических свойств свободного (ФС) и иммобилизованного (ФС-Аи) пигментов в экспериментах на крысах с саркомой М-1 показало, что иммобилизация бактериопурпуринимида на НЧ золота увеличивает время циркуляции наноструктурированного ФС в кровотоке и повышает его тропность к опухоли за счет неспецифического таргетинга, включающего экстравазацию наночастиц, нагруженных пигментом, из дефектных сосудов опухоли.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: бактериохлорофилл а, бактериопурпуринимид, фотосенсибилизаторы, фотодинамическая терапия, липоевая кислота, наночастицы золота, саркома М-1.
* Адресат для корреспонденции.
891
9*
Основными методами лечения в онкологии являются хирургическое вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия. Однако в последние два десятилетия все большее распространение получают новые методы, среди которых следует отметить фотодинамическую терапию (ФДТ), которая является результатом комбинированного действия трех нетоксичных компонентов — фотосенсибилизатора, света и кислорода [1—3]. Противоопухолевые эффекты данного вида лечения обусловлены комбинацией прямого фотоповреждения клеток, разрушения сосудистой сети опухоли и активации иммунного ответа [4—6].
Данный метод лечения обладает малой инва-зивностью, высокой избирательностью поражения опухоли, низкой токсичностью вводимых препаратов и отсутствием риска тяжелых местных и системных осложнений.
Вместе с тем важным фактором, ограничивающим применение ФДТ при лечении онкологических заболеваний, является недостаточная глубина проникновения светового излучения, а также невысокая селективность накопления офи-цинальных фотосенсенсибилизаторов в опухоли [7, 8].
В настоящее время применяются в клинике или находятся на разных стадиях клинических испытаний фотосенсибилизаторы (ФС) различных классов (порфирины и их металлокомплек-сы, хлорины, бензопорфирины, фталоцианины и др.). Среди них особый интерес представляют природные бактериохлорофиллы и их производные с интенсивным поглощением в ближней ИК-области спектра в районе 800 нм, поскольку это открывает новые возможности для диагностики и лечения злокачественных новообразований. Свет с подобной длиной волны проникает в ткань на глубину до 20 мм, что позволяет проводить лечение глубокозалегающих и пигментированных опухолей [9, 10].
Выбор природных пигментов для создания новых ФС обусловлен рядом причин, включая их распространенность в природе, интенсивное поглощение в длинноволновой области спектра, возможность химической модификации боковых заместителей, структурную близость к эндогенным порфиринам, что предполагает низкий уровень токсичности подобных соединений и быстрое выведение из организма.
Однако сами хлорины и бактериохлорины имеют ограниченное применение в качестве ФС из-за высокой гидрофобности, низкой химической и фотостабильности, умеренной селективности накопления в раковых клетках. Это диктует необходимость создания их устойчивых производных с улучшенными спектральными характерис-
тиками, повышенной гидрофильностью для растворимости в полярных растворителях и воде, обладающих значительной тропностью к опухолям [11-15].
Применение наночастиц (НЧ) золота с иммобилизованными на них фотосенсибилизаторами открывает новые возможности для повышения результативности фотодинамической терапии.
Наночастицы золота обладают целым рядом уникальных характеристик, таких как оптические свойства, прочность, высокая площадь поверхности, химическая инертность и способность противостоять окислению даже в ультрадисперсном (наноразмерном) состоянии.
Важным достоинством НЧ золота является их способность накапливаться в опухолевой ткани путем пассивного таргетинга за счет экстраваза-ции наноразмерных материалов из дефектных сосудов опухоли [16-18], либо путем векторной доставки к поврежденной ткани за счет функци-онализации поверхности НЧ биологически активными макромолекулами, придавая конъюга-там направленность взаимодействия с экзо- и эн-доклеточными молекулярными компонентами. В зависимости от формы, размера и характера функционализации поверхности наночастицы золота могут проникать внутрь клеток путем эн-доцитоза или закрепляться на внешних структурах клеточной мембраны [19-21].
В последние годы появились научные исследования, в которых успешно реализуется доставка противоопухолевых агентов для химиотерапии [22, 23], а также фотосенсибилизаторов для ФДТ рака с помощью НЧ золота [24-26].
Расширение показаний применения фотодинамической терапии связывают с возможностью ее комбинации с другими методами лечения, в том числе лучевой терапией [27, 28] и локальной гипертермией [29-31].
Считается, что комбинация ФДТ и лучевой терапии может существенно улучшить результаты лечения и уменьшить применяемые дозы ионизирующих излучений, а кроме того, позволит эффективно воздействовать на радиорезистентные опухоли. При облучении рентгеновским излучением с энергией ~100 КэВ, наночастицы золота испускают фотоэлектроны, имеющие достаточно малую длину свободного пробега в теле и быстро передающие свою энергию окружающим клеткам. Таким образом, усиление действия в зоне интереса является достаточно существенным.
В свою очередь, повышение концентрации фотосенсибилизатора, доставленного в опухоль на золотых наночастицах, и реализация фотодинамического воздействия за счет облучения по-
раженной ткани лазерным излучением увеличивает эффективность комбинированной терапии.
Применение НЧ перспективно также в случае использования сочетанной ФДТ и лазерной гипертермии опухолей. Возбуждение плазмонов в наночастицах золота квантами света в видимой или ближней ИК-области спектра приводит к повышенному поглощению и рассеянию ими зондирующего излучения. Путем изменения формы и размера наночастиц можно контролировать длину волны плазмонного резонанса и получать частицы с заданными оптическими свойствами.
Облучение опухоли лазерным излучением, соответствующим длине волны поглощения на-ночастиц золота, может вызвать локальную гипертермию опухоли за счет их разогрева. Селективное накопление наночастиц в опухолевой ткани резко повышает градиент температуры между опухолью и окружающими здоровыми тканями, что обеспечивает локальность нагрева опухоли. Это делает лазерное воздействие прицельным и снижает его негативное влияние на нормальные ткани. Это открывает широкие перспективы использования локальной лазерной гипертермии в онкологии.
В настоящей работе проведен синтез ауро-фильного производного Бхл а, которое было ко-валентно присоединено к НЧ золота, изучены спектральные, фотофизические и биологические свойства полученного наноструктурирован-ного ФС.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы раствор гидразин гидрата (Hydrazine Hydrate Solution, «Merck», Германия), а-липоевая кислота (Alpha Lipoic Acid, «Sigma-Aldrich», США), Кремофор ELP (Cremophor ELP, «BASF», Германия), а также реагенты и растворители отечественного производства. Растворители были очищены и подготовлены по стандартным методикам. Бактериопур-рин получен из бактериохлорофилла а с использованием разработанного нами метода [32].
Хроматографию в тонком слое осуществляли на пластинках Kieselgel 60 F254 («Merck», Германия) в хлористом метилене. Спектры ЯМР регистрировали в дейтерохлороформе на спектрометре «Bruker» DPX-300 (Германия) с рабочей частотой 300 МГц. Масс-спектры получены на время-пролетном масс-спектрометре «Bruker» Ultraflex TOF/TOF (Германия) методом MALDI с использованием в качестве матрицы дигид-роксибензола (DHB). Электронные спектры
поглощения получены на спектрофотометре Ultrospec 2100 Pro («GE Healthcare», США), в кварцевых кюветах толщиной 10 мм. Все спектральные исследования выполняли п
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.