МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 4, с. 433-437
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.61:57.088.2:57.088.3
РАЗРУШЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК РЕКОМБИНАНТНЫМ ДИСПЕРСИНОМ B
© 2015 г. О. Ю. Добрынина1, Т. Н. Большакова, А. М. Умяров, И. С. Бокша, Н. В. Лаврова, А. В. Гришин, А. М. Лящук, З. М. Галушкина, Л. Р. Аветисян, М. Ю. Чернуха, И. А. Шагинян, В. Г. Лунин, А. С. Карягина
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва
Поступила в редакцию 08.12.2014 г.
В клетках Escherichia coli клонирован и экспрессирован синтетический ген, кодирующий белок, последовательность которого соответствует таковой дисперсина В из Aggregatibacter actinomycetemcom-itans. Разработан метод очистки и проведено тестирование активности рекомбинантного дисперсина В in vitro. Этот фермент использован в опытах по разрушению биопленок, образованных микрор-организмами разных видов. Наибольшую активность рекомбинантный дисперсин В проявлял в отношении биопленок, формируемых Staphylococcus epidermidis. Биопленки, образованные Burkholderia cenocepacia и Achromobacterxylosoxidans, оказались более устойчивы к действию фермента.
Ключевые слова: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Burkholderia cenocepacia, Achromobacter xylosoxidans, рекомбинантный дисперсин В, гетерологичная экспрессия, разрушение биопленок.
DOI: 10.7868/S0026365615040060
Биопленки, образуемые рядом микроорганизмов, способствуют их выживанию в изменяющейся среде обитания. Матрикс микробных биопленок представляет собой сложную гетерогенную структуру, включающую белки, нуклеиновые кислоты, липиды, фосфолипиды и другие вещества, но основным компонентом являются экзогенные полисахариды, синтезируемые микроорганизмами [1]. Ферментативная деградация матрикса рассматривается как один из перспективных методов разрушения биопленок [2] с целью борьбы с микробными загрязнениями и заражениями.
У ряда бактерий в составе полисахаридного компонента биопленок выявлен поли-Р-1,6-М-ацетил-Э-глюкозамин [3, 4]. В настоящее время известен только один фермент, способный разрушать поли-Р-1,6-М-ацетил-Э-глюкозамин, — это дисперсин В, синтезируемый патогенной бактерией ротовой полости человека Aggregatibacter actinomycetemcomitans [5, 6]. Дисперсин В — это белок с молекулярной массой 40 кДа, представляющий собой гликозилгидролазу и относящийся к 20 семейству Р-гексозаминидаз (ЕС 3.2.1.52) [6, 7].
1 Автор для корреспонденции: (e-mail: olgadbrnn@ram-bler.ru).
Для решения задач, связанных с разрушением матрикса бактериальных биопленок дисперси-ном B, необходимо использовать либо фермент, выделяемый из природного источника (A. actino-mycetemcomitans) [7], либо получить рекомбинантный дисперсин B [8, 9]. С точки зрения биотехнологии целесообразно второе решение.
Цель настоящей работы — получение очищенного рекомбинантного дисперсина В и изучение его влияния на биопленки, сформированные разными видами бактерий. Для этого проведено клонирование в клетках Escherichia coli синтетического гена, кодирующего последовательность дисперсина В из A. actinomycetemcomitans. Белок наработан в штамме-продуценте, выделен и очищен, после чего исследовано его действие на биопленки Staphylococcus epidermidis, Burkholderia cenocepacia и Achromobacter xylosoxidans.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования и условия культивирования. В работе использованы следующие микроорганизмы: Achromobacter xylosoxidans SCCH3: Ach 33-1365 glt allele 2; Burkholderia cenocepacia SCCH2: Bcn33-1220 ST709 (штаммы из коллекции НИИ пульмонологии Минздрава РФ, Москва);
434
ДОБРЫНИНА и др.
Staphylococcus epidermidis 210 (штамм из коллекции культур лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций, ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава РФ).
S. epidermidis выращивали в бульоне Мюллер-Хинтон, остальные бактерии — в L-бульоне при 350С с интенсивной аэрацией на термостатируе-мых качалках в течение 16 ч в 200-мл колбах с 20 мл среды. Выращенные культуры использовали как инокуляты.
Клонирование гена dspB, кодирующего диспер-син В из A. actinomycetemcomitans. Последовательность синтетического гена, использованная для клонирования в E. coli, была спланирована с учетом кодонного состава E. coli и отсутствия выраженной вторичной структуры мРНК. Для последующего клонирования последовательность была фланкирована сайтами рестрикции Ncol и Kpn2I. Аминокислотная последовательность, кодируемая синтетическим геном, соответствует последовательности белка гликозилгидролазы Dispersin B из A. actinomycetemcomitans (DspB) (NCBI Reference Sequence: ZP 11583848.1). Синтез олигонуклеотидов и сборка гена проводилась в ЗАО "Евроген" (Россия, Москва). Для клонирования использовали вектор pQE13 и штамм E. coli M15 [pREP4], (F-, Nals Str* Rif lac- ara- gal- mtl-) ("Quagen", США). Идентичность нуклеотидной последовательности клонированного гена таковой гена дисперсина B была подтверждена секвенированием. Расчетная (по аминокислотной последовательности) молекулярная масса рекомбинантного дисперсина B составляла 43.3 кДа.
Выделение и очистка рекомбинантного диспер-сина 6His-DspB. Для получения биомассы по 2 мл 16-часовой культуры штамма-продуцента E. coli M15 (6His-DspB) засевали в колбы Эрленмейера объемом 500 мл с 200 мл жидкой среды LB с канами-цином (25 мкг/мл) и ампициллином (150мкг/мл). Выращивание проводили на термостатируемом ротационном шейкере (700 об./мин, 370С) до достижения культурой оптической плотности 1.0—1.5 при 600 нм, определенной с помощью спектрофотометра Ultrospec 1100 pro ("Amersham", США) в кювете шириной 1 см. Затем добавляли изопро-пил^^-тиогалактозид (ИПТГ) до концентрации 0.2 мМ и продолжали культивирование еще 12 ч при 250с. Биомассу собирали центрифугированием на центрифуге 4K15 Sigma (США) при 6000 g в течение 15 мин и отмывали от среды роста 0.9% раствором NaCl. Выход биомассы составил около 4 г/л. Полученную биомассу использовали далее для выделения целевого белка.
Для этого 600 мг сырой биомассы клеток суспендировали в 2.5 мл буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7.5 и 50 мМ NaCl), клетки лизировали лизоци-мом (200 мкг/мл) при комнатной температуре в течение 30 мин. Лизат обрабатывали ультразву-
ком во льду в течение 2 мин в импульсном режиме с интервалами 5 с, импульсами мощностью 30% от максимальной на установке Bandelin Sonopuls ("Bandelin Electronics", Германия). Объем полученной суспензии разрушенных клеток доводили до 4 мл буфером вышеуказанного состава, дебрис удаляли центрифугированием 10000 g на центрифуге Eppendorf 5424 (Германия) в течение 15 мин при 4°C. Объем супернатанта доводили до 4 мл буфером, добавляли к нему 121 мкл буфера, содержащего 1 М имидазол-HCl, рН 8.0, и затем 1.33 мл 50%-ной суспензии аффинного сорбента Workbeads Ni Bio-Works 40, предварительно уравновешенного 30 мМ имидазол-HCl буфером, рН 8.0. Через 30 мин инкубации при 4°С эту смесь переносили в хроматографическую колонку (диаметр 10 мм, высота 10 см). Хроматографию проводили при комнатной температуре на установке Bio Logic LP ("Bio-Rad", США). Колонку промывали 12 мл 1 М раствора NaCl в 20 мМ трис-HCl, pH 7.5 с 30 мМ имидазола, затем белок элюировали буфером 1 М имидазол-HCl, pH 8.0. Собирали фракцию, содержащую целевой белок, объемом 2.5 мл, с концентрацией белка 9 мг/мл и следующие за ней фракции общим объемом 3 мл и концентрацией белка 1.8 мг/мл. Собранные фракции диализовали в течение 16 ч против буфера 20 мМ трис-HCl, рН 8.0 (2 смены по 500 мл). Концентрацию белка определяли методом Лоури.
Лиофилизацию очищенного дисперсина B проводили из объема 200 мкл (раствор в буфере трис-HCl 20 мМ, рН 8.0) в концентрациях 2.5, 6 и
9 мг/мл. Флаконы после высушивания были закупорены под вакуумом.
Определение активности выделенного фермента дисперсина В. Ферментативную реакцию проводили по методу, разработанному ранее [6], в реакционной смеси объемом 1.5 мл. Смесь содержала 50 мМ К-фосфатный буфер, рН 5.9, 100 мМ NaCl и 10—100 мкг очищенного целевого белка. Реакцию начинали, добавляя к прогретой до 37°С смеси 0.5 мл раствора 4-нитрофенил^-ацетил-ß-D-глюкозаминида (4 мг/мл) ("Sigma") в фосфатном буфере вышеуказанного состава. Реакцию проводили при 37°С и останавливали добавлением
10 мкл 10 N NaOH. Оптическую плотность раствора (Е) измеряли при 420 нм. Специфическую активность фермента рассчитывали по формуле A = E420/(0.0045 х C х T), (где С — концентрация белка в пробе (мг), Т — время реакции (мин), 0.0045 — коэффициент молярной экстинкции 4-нитрофенола при 420 нм).
Образование биопленок. Бактерии выращивали на агаризованной (1.8%) среде (L-агар) в течение 24 ч. Выросшие культуры бактерий засевали петлей в 5 мл бульона и выращивали с интенсивной аэрацией при 35°C в течение 16 ч. Опыты по образованию биопленок проводили, как описано
РАЗРУШЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК
435
[10, 11] в стерильных 96-луночных планшетах "^star" (США). Объем пробы составлял от 100 до 200 мкл. Концентрация бактерий в каждой ячейке планшета была равна 105 КОЕ/мл для S. epidermidis (в бульоне Мюллер-Хинтона) и 106 КОЕ/мл для A. xylosoxidans и B. cenocepacia (в среде М9 с 0.4% казаминовых кислот). Планшеты инкубировали при 35°C при повышенной влажности без перемешивания в течение 24—72 ч. Образовавшуюся на стенках ячейки биопленку окрашивали в течение 30 мин 0.1% раствором красителя кристаллвиолета (для S. epidermidis — 0.1% раствором генцианвиолета) при комнатной температуре, дважды промывали 0.9% раствором NaCl и добавляли 250 мкл 30% уксусной кислоты (для S. epidermidis — 100 мкл 96% этанола). Оптическую плотность полученных в ячейках растворов измеряли при 540 нм с помощью прибора Multiscan FC ("Thermo Scientific", США). Следует отметить, что скорость образования устойчивых биопленок в ячейках планшета у использованных культур была различной: у A. xylosoxidans и B. cenocepacia — она составляла 48 ч, а у S. epidermidis — 72 ч.
Влияние дисперсина В на биопленки. Активность выделенного рекомбинантного ферме
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.