ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 5, с. 581-600
ОБЗОРНЫЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СТАТЬИ
УДК 575.1:576.364
РАЗРЫВЫ ДНК В ХОДЕ КЛЕТОЧНОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
© 2007 г. Н. И. Сьяксте1' 2, Т. Г. Сьяксте3
1 Латвийский университет, г. Рига LV-1001, Латвия 2 Латвийский Институт органического синтеза, г. Рига LV-1006, Латвия; факс: (371)755-03-38; e-mail: Nikolajs.Sjakste@lu.lv 3 Институт биологии Латвийского университета, г. Саласпилс LV-2169, Латвия
Поступила в редакцию 27.06.2006 г.
Обзор обобщает собственные результаты и данные литературы о накоплении разрывов ДНК в дифференцирующихся клетках. Высвобождение больших фрагментов ДНК в 50 тпн наблюдалось несколькими группами исследователей в неапоптозных клетках насекомых, млекопитающих и растений. Более интенсивная фрагментация ДНК наблюдалась при созревании сперматид, развитии эмбрионов, дифференцировке миобластов, эпидермальных клеток, лимфоцитов и нейтрофилов. Как правило, накопление разрывов ДНК нельзя объяснить снижением эффективности репарации в дифференцированных клетках. Фрагментация ДНК в дифференцированных клетках сопровождается интенсивным синтезом поли(ADP)рибозы. Мы предполагаем, что индукция разрывов ДНК является эпигенетическим инструментом регуляции процесса дифференцировки. Немногочисленные данные о локализации связанных с дифференцировкой разрывов ДНК указывают на их предпочтительное накопление в определенных последовательностях ДНК, включая точки прикрепления к ядерному матриксу, которые фрагментируются и на начальных стадиях апоптоза. Недавно опубликованные данные о неапоптозных функциях каспаз позволяют предположить возможность существования механизма индукции разрывов ДНК, напоминающего начальные стадии апоптоза. Экс-цизия 5-метил-цитозина и рекомбинация могут служить другими объяснениями явления. Выявление механизмов связанной с дифференцировкой фрагментации ДНК представляется перспективным направлением исследований.
Наступление постгеномной эры резко повысило интерес к эпигенетическим механизмам регуляции экспрессии генома. По определению Лью-ина, "эпигенетические изменения оказывают влияние на фенотип, не изменяя генотип, эти изменения свойств клетки являются наследуемыми, но не представляют из себя изменений генетической информации" [1]. Огромный интерес проявляется к метилированию ДНК, ацетилированию гистонов и т.д. В настоящей работе нам хотелось бы привлечь внимание к одно- и двунитевым разрывам ДНК как к возможному эпигенетическому фактору. Эта концепция развивалась в 80-е годы прошлого века. Ранее нами уже обобщались собственные данные и данные литературы о роли разрывов ДНК в процессах пролиферации и дифференцировки клеток животных [2-7] и растений [7-9], а также при старении и в развитии различных патологий [10-15]. Кажется, что в последующие годы бум исследований по апоптозу, где разрывы ДНК имеют фундаментальное значение, отвлек внимание от "физиологической" фрагментации ДНК. Вместе с тем появляются новые публикации на эту тему, а ряд вопросов, как, например, локализация мест образования двойных разрывов ДНК при рекомбинации в лимфоцитах, разрешен в последние годы. В настоящем обзоре нам хотелось бы обобщить современное состоя-
ние проблемы и обсудить возможные механизмы влияния эндогенных разрывов ДНК на экспрессию генов.
ТИПЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК
Прежде чем начать анализ возможной функциональной роли разрывов ДНК, следует уточнить, что имеется в виду под понятием "разрыв ДНК". Возможные варианты разрывов представлены на рис. 1. Разрыв может быть одно- и двунитевым. В первом случае это может быть разрыв сахарофосфатной цепи с 5'- или 3'-фосфатной группой (рис. 1,а, •). Потеря дезоксирибозы может привести и к разрыву с З'-фосфогликолат-ным концом (рис. 1,е). Частичная или остановленная репарация приводит к формированию бреши с 5'- и З'-Он концами (рис. 1,г), а остановка репликации может привести к обширному однонитево-му участку, образованному материнским тяжем, дочерний тяж при этом будет иметь свободный З'-ОН-конец (рис. 1,д). Двунитевые разрывы соответственно могут иметь тупые концы (рис. 1,е), нависающие 5'- или З'-концы (рис. 1ж, з), а в случае, если разрыв образован вследствие ингибиро-вания топоизомеразы II, он будет замаскирован белковым линкером (рис 1,ё). Методы определения разрывов ДНК были подробно обобщены ра-
5'
х
3.
"5
X
Однонитевые разрывы и бреши
он СР)"
1
X
X
X 3
X X
5' 3' 5' 3'
X X
X X
3_
X 3.
X X
X X
X_
он
Е.
5" X
X X
X
5
3'
5'
Е.
"б
X
он
X
он
X
X
X X
5'
3'
X X
ъ
X
он
^ у ф у
5'
3'
X X
X X
Двунитевые разрывы и бреши
-3
X
X X
3' 5'
5'
3'
5'
3'
5'
3'
[Ь X
Белок
с
х
□
X
У
А 6 А б
У А 6
У у
[Ь А ¿1 А
[Ь А Т 9
У Ф У 9
А
■2с
X X
X
9
Белок
Рис. 1. Типы разрывов ДНК. а - однонитевой разрыв с 5'-фосфатной группой; б - однонитевой разрыв с 3'-фосфатной группой; в - повреждение дезоксирибозы приводит к образованию бреши с 3'-фосфогликолатным концом; „ - репарация 3'-конца может образовать брешь с оксигруппами на 3'- и 5'-концах; д - ингибирование ДНК-полимеразы антиметаболитами приводит к образованию прерванного дочернего тяжа с 3'-ОН концом; е - на концах двунитевых разрывов могут находиться любые концевые группы, разрыв может также иметь тупые концы; ж - схема разрыва с зигзагообразно расположенными нависающими З'-концами; з - схема разрыва с зигзагообразно расположенными нависающими 5'-концами; и - разрывы, лигированные белком.
а
д
е
з
и
целит
нуклео-протеид
градиент NaCl 0-3 M
градиент LiCl-мочевины 0-4 M; 8 M
ДНК 0
- г
ДНК I
- с
4 M LiCl; 8 M мочевина
градиент
температуры
0-100°С
ДНК II
Г
ДНК 0 ДНК I ДНК II
1 2 3 4 5 6 7
а
1000500-
21.29.4-
■ 19
1 -
ДНК 0 ДНК I ДНК II
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 2. Нуклеопротеид-целит-хроматография. а - принцип получения хроматографических фракций; б, в - электрофорез в агарозном геле ДНК, осажденной из хроматографических фракций: б - препарат ядерного матрикса клеток HD3, в - лизат эритроцитов курицы. Слева обозначены положения маркеров длины фрагментов ДНК (тпн). Методические подробности опубликованы ранее [125].
нее [15]. Принципиально новые методы заслуживают отдельного рассмотрения [16]. Хотелось бы упомянуть лишь достаточно простой метод нук-леопротеид-целит-хроматографии, теперь незаслуженно забытый [15]. Метод позволяет разделить фракции ДНК по прочности связи с белком в нуклеопротеидах. Если хроматографировать препараты клеточных ядер или ядерного матрик-са, можно определить фракции ДНК, прочно и слабо связанные с ядерным матриксом. Это позволяет судить о внесении разрывов в последовательности ДНК, прилегающие к ядерному мат-риксу (рис. 2). Структурное разнообразие разрывов и различные принципы, лежащие в основе методов их определения, могут быть причиной противоречивости данных, о которых пойдет речь ниже.
СВИДЕТЕЛЬСТВА ПРЕРЫВНОСТИ ДНК В ЯДРАХ КЛЕТОК ЭУКАРИОТ
Нормальная жизнедеятельность клетки связана с образованием и репарацией разрывов ДНК, или модификаций структуры ДНК, которые могут регистрироваться как разрывы. В первую очередь следует помнить о процессах мейотиче-ской рекомбинации и V(D)J-рекомбинации при дифференцировке лимфоцитов, эти процессы не могут совершиться без индукции разрывов в ДНК [17], как подтверждение существования этих разрывов можно упомянуть выявление фосфорили-рованной формы белка ATM, а этот белок фос-форилируется в ответ на повреждение ДНК, в лимфоцитах и сперматоцитах [18]. Далее, если даже допустить, что на клетку не воздействует ни-
а
1 2
12 3 4
23.6—
23.6—
м
9.6—
I I
1 2
2200— I
1125—
2200—
240—
240—
Рис. 3. Исследование степени фрагментации ДНК в разных индивидуумах шпорцевой лягушки разными модификациями электрофореза. Во всех случаях эритроциты заплавлялись в агарозные блоки, после чего проводился лизис клеток. а - электрофорез в щелочных условиях (дорожки 1,2 - два индивидуума); б - электрофорез в нейтральных условиях: 1 - ДНК фага X, "перееденная" рестриктазой НМШ, 2, 3, 4 -три индивидуума; в, г - пульс-электрофорез в разных условиях; г: 1,2 - два индивидуума. Слева обозначены положения маркеров длины фрагментов ДНК (тпн). Методические подробности опубликованы ранее [29].
какой генотоксичный или запускающий апоптоз агент, ДНК все равно повреждают нормальные метаболиты [19]. При этом в основном образуются модифицированные основания, разрывы возникают при их репарации, разрывы могут образовываться на месте апуриновых и апиримидино-вых сайтов, эти участки регистрируются как разрывы ДНК методами, предусматривающими обработку образца щелочью. Однонитевые структуры репликативной вилки также регистрируются как однонитевые разрывы или бреши, рекомбинация и активность топоизомеразы II сопровождаются образованием двунитевых разрывов ДНК, а действие топоизомеразы I - однонитевых разрывов. При определенных условиях эти разрывы могут быть обнаружены электрофорезом в пульсирующем поле [20]. Помимо этого, некоторые исследователи считают, что ДНК эукариот должна прерываться белковыми [21] или липид-ными [22] линкерами. Подобную прерывность, видимо обусловленную не доведенной до конца реакцией, катализируемой топоизомеразой II, обнаруживают во многих клетках растений и животных, выявляются двунитевые фрагменты ДНК размером 50-100 тпн [23]. Сформулирована концепция о "форум-ДНК", которая также выявляется как быстро мигрирующая фракция (50100 тпн) при разделении ДНК различных организмов электрофорезом в пульсирующем поле. Авторы считают, что эта фракция образуется в результате неизбежного действия эндонуклеаз при приготовлении препарата [24-26]. Фрагменты ДНК в 50 тпн обнаружены в клетках различных пролиферирующих культур животных клеток без признаков клеточной гибели [21]. Более того, эта же группа авторов показала, что в ДНК многих клеток имеется однонитевой разрыв на каждые 50 тпн [27], и продемонстрировала, что эти разрывы можно обнаружить и цитологически, применяя TUNEL-assay, однако препарат надо предварительно обработать протеазой [28]. Эти данные опять наводят на мысль о белковых линкерах. Один из авторов этого
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.