научная статья по теме РАЗВИТИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ НИЗКОЙ ВЛАЖНОСТИ Биология

Текст научной статьи на тему «РАЗВИТИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ НИЗКОЙ ВЛАЖНОСТИ»

ИЗВЕСТИЯ РАИ. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2007, № 3, с. 296-302

^=МИКРОБИОЛОГИЯ

УДК 631.41

РАЗВИТИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ В УСЛОВИЯХ НИЗКОЙ ВЛАЖНОСТИ

© 2007 г. Д. Г. Звягинцев, Г. М. Зенова, Е. А. Дорошенко, А. А. Грядунова,

Т. А. Грачева, И. И. Судницын

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения,

119992 Москва, Ленинские горы

E-mail: manuchrova@mail.ru Поступила в редакцию 30.06.2006 г.

Показано, что в сообществах актиномицетов имеет место смена родового состава во времени и в зависимости от условий увлажнения почвы. При разных уровнях увлажнения (полевой влагоемкости, максимальной молекулярной влагоемкости и максимальной адсорбционной влагоемкости) постоянно выделяются из почвы представители родов Streptomyces, Micromonospora, Actinomadura, Saccha-ropolyspora, Microbispora. Представители некоторых редких родов (Thermomonospora, Kibdelospo-rangium) изолируются из почвы при низких уровнях влажности, препятствующих развитию более влаголюбивых актиномицетов и бактерий. Установлено, что споры некоторых актиномицетов способны прорастать при низкой относительной влажности (ОВ) воздуха (50%, 67%). Полный цикл развития всех актиномицетов, начиная от прорастания спор до нового спорообразования, происходит только при ОВ 98%.

Влажность является важным фактором, влияющим на способность микроорганизмов к росту и развитию (Жизнь микробов..., 1981; Современная микробиология, 2005).

Границы влажности, при которых организм способен развиваться, обусловливают его распространение в наземных экосистемах. Традиционно считается нижней границей, при которой возможен рост микроорганизмов, давление влаги равное -70 МПа. Организмом, способным развиваться в таких условиях, является гриб Xeromyces bysporus (Griffin, 1963, 1969). Прокариоты, за исключением экстремальных галлофилов, гораздо более требовательны к потенциалу влаги, чем грибы и большинство из них развиваются в диапазоне от -4 МПа и выше (Griffin, 1969).

Известно, что актиномицеты, по сравнению с другими бактериями, более устойчивы к высушиванию почвы (Калакуцкий, Агре, 1977; Звягинцев, Зенова, 2001). Экзоспоры стрептомтицетов сохраняют жизнеспособность в условиях полного высушивания. В высушенных образцах почв и листьев длительно сохраняются споры в спорангиях актиноплан (The Prokaryotes..., 1991). В почвах аридных районов актиномицеты составляют 25% от всех бактерий в комплексе почвенных прока-риотных организмов (Звягинцев, Зенова, 2001).

Однако в литературе не приводится экспериментальных доказательств вегетативного роста мицелиальных прокариот при низких значениях влажности. Результаты исследования чистых культур актиномицетов свидетельствуют о том, что устойчивость актиномицетов к обезвоживанию обусловлена устойчивостью спор; вегетатив-

ные гифы мицелиальных прокариот быстро повреждаются под действием высушивания (Williams et al, 1972).

Целью работы явилось исследование динамики плотности популяций актиномицетов разных родов в сукцессии, инициированной увлажнением почвы до разных уровней влажности и определение интенсивности прорастания спор и роста мицелия стрептомицетов в модельных опытах при заданных уровнях влажности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Образцы осушенной агроторфяной типичной почвы были отобраны на территории Дмитровского филиала ГНИУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственного использования мелиорируемых земель (ВНИИМЗ), расположенного в южной таежной подзоне на Клинско-Дмитровской гряде в долине р. Яхромы в Дмитровском р-не Московской обл.

В лабораторных исследованиях для проведения модельного опыта по изучению динамики численности почвенных актиномицетов в ходе инициированной микробной сукцессии воздушно-сухую почву (20 г), освобожденную от крупных корешков и посторонних включений, растирали в фарфоровой ступке и просеивали через сито в 1 мм. Почву помещали в чашки Петри, тщательно перемешивали и увлажняли до трех различных уровней влажности: полевой влагоемкости (ПВ) (136% от массы почвы), максимальной молекулярной влагоемкости (ММВ) (64% от массы почвы), максимальной адсорбционной влагоемкости

(MAB) (22% от массы почвы) (таблица). Опыт проводили в 2-кратной повторности. Инкубировали чашки с почвой при поддержании указанного уровня влажности при 20-22°C в эксикаторах, которые открывали на 30 мин через сутки. Посевы почвенных образцов производили в момент инициации сукцессии (0-момент), на 3, 7, 14, 21, 28-е сут после инициации сукцессии.

Дифференцированный учет актиномицетов проводили методом поверхностного посева из разведений почвенной суспензии на агаризован-ную питательную среду. Использовали среду с пропионатом натрия, в которую добавляли комплекс антибиотиков, включающий налидиксовую кислоту (1.5 мкг/мл), рубомицин (1.0 мкг/мл), нистатин (50 мкг/мл), а также витамин Бх и микроэлементы (Зенова, Звягинцев, 2002).

Инкубацию посевов проводили при 28°C в течение 3-4 нед. Подсчитывали общее число выросших колоний актиномицетов и проводили их дифференцированный учет по морфологическим типам. Представителей каждого типа выделяли в чистую культуру и проводили предварительную родовую идентификацию, используя дифференциальные таблицы Определителей бактерий Берджи (Определитель..., 1997; Bergey's manual of systematic., 1989; Bergey's manual determinative., 1994). Для этого использовали морфологические характеристики актиномицетов (наличие фрагментации, тип ветвления мицелия, присутствие и характер расположение спор на воздушном и/или субстратном мицелии, число спор в цепочках, диаметр спор, наличие спорангиев, подвижность спор) и хемотаксономические признаки (присутствие в гидролизатах целых клеток LL- или мезо-диаминопимелиновой кислоты (ДАПк) и дифференцирующих Сахаров) (Hasegawa et al., 1983).

B модельных опытах по изучению прорастания спор и роста мицелия актиномицетов в условиях различной влажности использовали следующие культуры: четыре штамма Streptomyces: S. odorifer штамм № 1, S. rectiviolaceus штамм № 3, S. violaceus штамм СЗ, S. violaceoruber штамм 7; два штамма Actinomadura: A. aurantiaca штамм 107, A. yumaensis штамм 23 и два штамма Micromonospora: M. chalcea штамм 98, М. nigra штамм 24, выделенные из различных растительных и почвенных субстратов и хранящиеся в музее кафедры биологии почв факультета почвоведения МГУ им. M.B. Ломоносова.

Для приготовления препаратов моноспоровые суспензии стрептомицетов (105 кл./мл, 1 капля, распределенная на площади 1 см2) наносили на предметные стекла, подсушивали до воздушно-сухого состояния и просчитывали среднее число спор в поле зрения (микроскоп Axiostar, Х1000). Стекла помещали в эксикаторы с насыщенными растворами определенных солей (Глобус, 1969), где были созданы определенные уровни влажности воз-

Характеристика влажности воздуха в эксикаторах в модельном эксперименте с актиномицетами

Уровень влажности Соль Относительная влажность, % Давление влаги, МПа Потенциал почвенной влаги, Атм

1 K2SO4 98 -2.8 -27.6

2 КС1 86 -22.6 -223.0

3 Ca(NO3)2 50 -96.4 -961.5

духа (таблица) и инкубировали в термостате при 28 ± 1°C. Уровень влажности воздуха (таблица) в эксикаторах контролировали цифровым термо-влагометром Viking AB (Германия) с погрешностью измерения влажности воздуха не более 1%. Стекла просматривали под микроскопом через 8, 24 и 72 ч экспозиции в эксикаторе. Подсчитывали число проросших спор (число спор с ростовыми трубками) и длину проростков мицелия. Просмотренное стекло назад в эксикатор не помещали, и следующее определение проводили на стекле, остававшемся все время в эксикаторе.

В опытах по наблюдению за развитием актиномицетов при разном осмотическом давлении влаги использовали агаризованную глицерин-нитратную среду с различным осмотическим давлением, которое создавали определенной концентрацией глицерина в среде. Предварительно строили кривую зависимости осмотического давления от концентрации глицерина в среде (рис. 1). Использовали три значения влажности: 67%, (-53.6 МПа), 86%, (-22.6 МПа), 98%, (-2.8 МПа). Создание влажности ниже значения 67% с использованием глицерина невозможно.

Для определения радиальной скорости роста колоний стрептомицетов на агаризованной среде с различным осмотическим давлением споры стрептомицетов помещали с помощью стерильной препаровальной иглы на поверхность агаризованной среды в чашке Петри (посев методом укола). Чашки инкубировали в термостате 14 сут при 28°C в эксикаторах. Влажность в эксикаторах контролировали при помощи термовлагомера Viking AB. Диаметр колоний стрептомицетов измеряли под микроскопом с помощью окуляра-микрометра или под лупой с помощью штангенциркуля. Первое измерение проводили через 48 ч инкубирования, а затем через каждые двое суток. Наблюдения продолжали 14 сут. Расчет радиальной скорости роста колоний (Кг проводили по формуле:

K = (d2 - dx)/(t2 - t) (1)

где d1 и d2 - диаметр колонии в начальный и конечный моменты измерения соответственно, мм; t1 и t2 - время начального и конечного измерения,

(а)

il

Рис. 1. Динамика популяционной плотности Strepto-myces (1) и Micromonospora (2) в ходе микробной сукцессии, инициированной увлажнением агроторфяной типичной почвы до разных уровней влажности: полевой влагоемкости (а), максимальной молекулярной влагоемкости (б) и максимальной адсорбционной влагоемкости (в); N - численность, КОЕ/г почвы. По оси абсцисс - время инкубации, сут.

сут. Измерения проводили в 20-кратной повтор-ности.

В случае, если к 14-м сут роста не наблюдали формирования колоний стрептомицета, то просчитывали под микроскопом количество мест посева спор стрептомицета на чашках Петри (мест "уколов"), в которых наблюдалось прорастание спор (образование ростовых трубок), и рассчитывали процент "уколов" с проросшими спорами от всех "уколов" на чашках Петри.

Оценивали степень развития стрептомицета при разной влажности по следующим показателям: наличие проросших спор, интенсивность ветвления проростков, образование микроколоний, формирование воздушного мицелия, формирование спор на воздушном мицелии.

Для определения динамики дыхания актиномицетов в среде с различным давлением влаги культуры ак

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком