ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 3, с. 198-205
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ
УДК 591.392:591.31:59.089.843
РАЗВИТИЕ ИКРИНОК ВЬЮНА ПОСЛЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО УВЕЛИЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ МАССЫ ДОРСАЛЬНОЙ И ВЕНТРАЛЬНОЙ ОБЛАСТЕЙ БЛАСТОДЕРМЫ
© 2004 г. Л. А. Слепцова, Е. Е. Иванова, В. А. Голиченков
Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
119992 Москва, Ленинские горы Поступила в редакцию 17.02.03 г.
Окончательный вариант получен 22.09.03 г.
В оплодотворенные яйцеклетки вьюна до наступления дробления инъецировали витальный ядерный краситель Хёхст 33258 и оставляли их развиваться до стадии 8 поздней бластулы. Часть клеток дорсальной области окрашенной бластодермы трансплантировали в одноименную область одно-возрастных интактных зародышей, что приводило к более раннему и более выраженному формированию у реципиентов головных и туловищных структур. Выявлена связь между особенностями развития реципиентов и локализацией потомков трансплантированных клеток. Трансплантация клеток дорсальной области окрашенной бластодермы в вентральную одновозрастным зародышам приводила к образованию двух осевых комплексов, одинаковых по степени развития, но отстающих от контроля, причем окрашенные клетки находились преимущественно в одном из зародышей-близнецов.
Ключевые слова: вьюн, бластула, бластодерма, трансплантация, регуляция, потенции клеток, витальный ядерный краситель Хёхст.
Известно, что одним из способов изучения потенций клеток, изменения направлений или скорости дифференцировок и морфогенезов является экспериментальное увеличение или уменьшение объемов эмбриональных закладок. Д.П. Филатов первым установил наличие связи между увеличением объема недифференцированного зачатка конечности и возникающей в нем гистологической дифференцировкой - закладкой скелетных элементов, которая в увеличенном зачатке наступала раньше, чем в контроле (Полежаев, 1945). Он сделал вывод о том, что дифференцировка зачатка конечности обусловливается его объемом. Важно отметить, что увеличение зачатка на более позднем этапе, близком к началу обособления скелетных закладок, на стадии выпуклой почки, приводит к дисгармонии развития конечностей. Способность к регуляции зачатка понижается.
Г.В. Лопашов сращивал фрагменты, выделенные из области презумптивной головной мезодермы ранней гаструлы амфибий. Одиночные эксплантаты развивались обычно в поперечнополосатые мышцы без хорды и каких-либо других тканевых компонентов. При культивировании двух-четырех таких фрагментов образовывалась компактная масса, в которой нередко развивались участки хорды. Комбинация из
четырех-пяти фрагментов приводила к образованию мышц, хорды и эпидермиса. При увеличении числа фрагментов до шести-десяти в них образовывались четкие мозговые структуры. Результаты этих опытов продемонстрировали зависимость дифференцировки от массы исходного материала и выявили нейральную компетенцию презумптивной мезодермальной области (Лопашов, 1935; Полежаев, 1945).
Бластодерму Fundulus Нв1вгосШш культивировали в питательной среде и сравнивали диффе-ренцировку отдельных или сращенных бластодерм с дифференцировкой нескольких бластодерм, помещенных вместе в небольшом объеме среды. Было отмечено, что при сращивании двух бластодерм или увеличении их суммарной массы в небольших перенаселенных культурах наступает усиление дифференцировки (Саксен, Тойво-нен, 1963).
В настоящее время на кафедре эмбриологии МГУ продолжаются исследования эмбриогенеза вьюна, в частности потенций клеток ранних зародышей и регуляционных процессов раннего развития (Слепцова и др., 2000). В экспериментах по трансплантации ядер у костистых рыб вообще и у вьюна в частности было показано, что ядра клеток бластулы эквипотенциальны и тотипотент-
ны. Однако это не означает, что клетки бластулы совершенно одинаковы по своим потенциям.
О карте презумптивных зачатков у аквариумной рыбки данио можно говорить уже после появления глубоких клеток, на стадии поздней бластулы. Глубокие клетки, локализованные у ани-мального полюса, дают начало эктодерме, а бластомеры, которые находятся ближе к краю обрастания, образуют мезо- и энтодерму. Дорсальные клетки формируют дорсальные и передние структуры, а вентральные - дорсальные, вентральные и задние структуры эмбриона (Kimmel et э1., 1990).
Первые же эксперименты, проведенные на бластуле вьюна с целью исследования потенций клеток, дали интересные результаты. Было показано, что удаление части клеток из дорсальной области бластодермы на стадии 8 (поздняя высокая бластула) приводит к преобладанию в дальнейшем развитии хвостовых структур и недоразвитию или отсутствию головных. Проведение точно такого же эксперимента на эмбрионах стадии 9 (поздняя эпителиальная бластула) приводило к недоразвитию (или отсутствию) хвостовых структур. Эти результаты позволили предположить, что клетки дорсальной области бластодермы вьюна на разных стадиях бластулы обладают различными потенциями. Интересные результаты дала пересадка клеток дорсальной области бластодермы стадии 10 (ранняя гаструла) на вентральную и латеральную стороны бластодермы зародышей стадии 7 (средняя бластула). При пересадке клеток на вентральную сторону формировался дополнительный зародыш и образовывались два параллельно расположенных осевых комплекса, а при пересадке на латеральную два зародыша располагались на желтке под некоторым углом друг к другу. По темпу развития такие зародыши сильно отставали от интактных, а сформировавшиеся структуры были нечеткими. Было сделано предположение о том, что на стадии 10 в дорсальной области бластодермы, видимо, находятся клетки, способные инициировать образование дополнительного осевого комплекса у более ранних зародышей (Слепцова и др., 1999). Безусловно, интересно было бы в таких экспериментах попытаться проследить судьбу подсаженных клеток, степень их участия в развитии и дифференцировке реципиента.
Для изучения судьбы отдельных клеток развивающихся зародышей или трансплантированных клеток применялись самые разные методы - от известных еще в начале прошлого века методов витальной маркировки и гетеротрансплантаций до современных, позволяющих пометить не только клетки, но и ядра. Это могут быть радиоактивные или флуоресцентные метки, а также использование эффекта экспрессии чужеродных генов у
трансгенных животных. Так, например, результаты экспериментов по введению экзогенного генетического материала в зиготы и клетки зародышей вьюна в ряде случаев показали возможность экспрессии чужеродной ДНК в эмбрионах и личинках различных стадий развития, что проявлялось в появлении отдельных точек или пятен, отличающихся по окраске, на поверхности головы, глаз, сомитов, на желточном мешке и на хвостовом плавнике (Андреева и др., 2003).
Для изучения внутриклеточных процессов в зиготе и бластуле вьюна применяли метод введения различных флуоресцентных красителей в яйцеклетки и эмбрионы (Корж, 1981; Корж и др., 1989а, б). В работах, в частности, использовали низкомолекулярный краситель Хёхст 33258. Этот краситель связывается с богатыми А-Т-свя-зями участками ДНК и окрашивает ядра бласто-меров. В работах, проведенных на кафедре эмбриологии (Слепцова, Попов, 1996а, б; Слепцова, Бенюмов, 1997; Sleptzova, Popov, 1997), бластодермы вьюна на стадии бластулы окрашивали флуоресцентным красителем Хёхст 33258, затем диссоциировали на отдельные клетки и подвергали сверхбыстрому замораживанию. Ядра клеток после размораживания трансплантировали в нео-плодотворенные яйцеклетки. У полученных зародышей на разных стадиях эмбриогенеза ядра клеток имели четкое свечение, что подтверждало их происхождение от донорского ядра.
В настоящей работе мы попытались, объединив несколько уже известных и вновь разработанных методик, несколько расширить границы ранее проводимых нами исследований процессов регуляции в раннем развитии костистых рыб. Сюда входило освоение метода тотального мечения зародышей вьюна до наступления дробления витальным красителем Хёхст 33258, пересадка меченых клеток дорсальной области бластодермы зародышей-доноров, находящихся на стадии поздней бластулы, в дорсальную и вентральную области одновозрастных эмбрионов-реципиентов и прослеживание судьбы бластомеров донора с помощью анализа экспериментальных зародышей под флуоресцентным микроскопом in vivo и на гистологических препаратах.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Объектом исследований служил вьюн Misgur-nus fossilis L., принадлежащий семейству вьюновых (Cobitidae), отряду карпообразных (Cyprini-formes), надотряду костистых рыб (Teleostei). Икру получали стандартным методом; стадии развития эмбрионов определяли с помощью таблиц нормального развития (Костомарова, 1975). После оплодотворения икру инкубировали в отстойной воде при температуре 14-18°С до необходимой стадии развития. Для операций исполь-
зовали микроинъектор, разработанный на кафедре эмбриологии МГУ и применявшийся в опытах с трансплантацией ядер, а также в экспериментах по исследованию регуляционных процессов в раннем развитии вьюна (Слепцова и др., 1990; Корвин-Павловская и др., 1996; Слепцова и др., 1999).
Окрашивание зародышей-доноров витальным флуоресцентным красителем Хёхст 33258. В работе использовали методику мечения целых зародышей вьюна витальным красителем Хёхст 33258 путем его инъекции в желток икринки через 30-60 мин после оплодотворения. Для инъекций использовали тот же микроинъектор и микропипетку диаметром 15-20 мкм с предварительно отградуированным кончиком. Краситель разводили в растворе Гольтфретера. Объем вводимого раствора составлял 20-40 нл на 1 икринку.
Трансплантация клеток дорсальной области бластодермы донора. Клетки дорсальной области бластодермы меченого зародыша на стадии 8 (поздняя высокая бластула) трансплантировали на дорсальную и вентральную стороны одновоз-растных неокрашенных эмбрионов. Во время операции зародыши помещали на дно чашки Петри, заполненной тонким слоем раствора Гольтфретера. Диаметр микропипетки составлял 50-90 мкм, что соответствовало примерно удвоенному диаметру бластомера на стадии поздней бластулы. Дорсальную и вентральную стор
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.