ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 3, с. 235-240
РЕГУЛЯЦИЯ ОРГАНОГЕНЕЗА ^^^^^^^^^^ ЖИВОТНЫХ
УДК 576.52:5765
РАЗВИТИЕ МЫШЕЧНОГО АППАРАТА И СОКРАТИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МИДИИ Mytilus trossulus (Mollusca: Eivalvia)1
© 2007 г. H. А. Одинцова, В. А. Дячук, А. А. Карпенко
Институт биологии моря им. A.B. Жирмунского ДВО РАН 690041 Владивосток, ул. Палъчевского, д. 17 E-mail:nelodin@mail.ru Поступила в редакцию 26.10.06 г. Окончательный вариант получен 20.11.06 г.
Проведен сравнительный анализ развития мышечного аппарата мидии Mytilus trossulus. Непрямая иммунофлуоресценция с помощью поликлональных антител против белка толстых нитей, твитчи-на, а также флуоресцентно меченный родамином фаллоидин как маркер актиновых филаментов были использованы для контроля изменений формирующейся мышечной системы личинок на разных стадиях развития. Установлено, что первые оформленные мышечные структуры появляются на стадии поздней трохофоры (36 ч развития), а начиная со стадии среднего велигера (96 ч развития) четко проявляется исчерченность мышечных структур (с периодом около 1.25 мкм), отсутствующая в гладких мышцах взрослых моллюсков. С помощью экспериментальной видеосистемы измерена сократительная активность мышц велигера и взрослого моллюска. В работе впервые представлено комплексное исследование морфологических, биохимических и физиологических характеристик мышечных систем личинок и взрослых моллюсков.
Ключевые слова: мидия, миогенез, моллюски, твитчин, толстые нити, "catch''-мышца.
В течение своего жизненного цикла моллюски формируют различные типы мышц, которые отличаются у личинок и взрослых особей. Личинки ранних стадий (бластула и трохофора) двигаются только с помощью ресничек. По морфологическим данным, первые личиночные мышцы наблюдаются на стадии ранней трохофоры (Wanninger et al., 1999; Wanninger, Haszprunar, 2002a, b), но специфическая, хорошо организованная мускулатура появляется только на стадии велигера (Малахов, Медведева, 1985). У велигеров двустворчатых моллюсков эта мускулатура состоит из пяти пар личиночных ретракторных мышц и отдельного прототрохного мышечного кольца (Cragg, Crisp, 1991). У педивелигеров помимо ретракторов паруса и аддукторов появляются дополнительные мышцы ноги (Cragg, 1996). Во время метаморфоза личинок прототрохное мышечное кольцо и апикальная мышечная сеть резорбируются (Малахов, Медведева, 1985). Передние и задние аддукторные мышцы, уже присутствующие и функционирующие на стадии позднего велигера (на стадии педивелигера, 10-14 сут после оплодотворения), формируют главную мышечную систему,
1 Работа частично поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 06-04-96039), Президиумом ДВО РАН (проект < 06-II-C0-06-025) и Программой Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология".
регулирующую смыкание раковины у взрослых мидий. Это типичные гладкие мышцы.
Толстые филаменты гладких мышц моллюсков имеют необычайно большие размеры. Эта уникальная структурная особенность толстых филаментов коррелирует с необычной функциональной особенностью этих мышц. Гладкие мышцы моллюсков могут находиться в сокращенном состоянии и поддерживать его в течение длительного периода времени практически без затраты энергии. Это состояние называется запи-рательным тонусом ("catch"), а мышцы, способные к нему, называются запирательными, или "catch''-мышцами (Ruegg, 1971). Для таких мышц характерен необычный состав белков толстых филаментов. Сердцевину этих филаментов образует белок парамиозин (Szent-Gyorgyi et al., 1971), а на поверхности парамиозинового стержня находится миозин (Elliott, 1974). Кроме того, с толстыми филаментами в "catch''-мышцах совместно локализованы два других белка, миород (Shelud'ko et al., 1999) и твитчин (мини-титин) (Vibert et al., 1993). Миород обнаружен только в гладких мышцах моллюсков, поэтому он может рассматриваться как специфический маркер такого типа мышц (Shelud'ko et al., 1999). Этот белок, функция которого пока неизвестна, является продуктом альтернативного сплайсинга мРНК тяжелой цепи миозина (Yamada et al., 2000). Твитчин обнаружен
как в гладких, так и в поперечно-полосатых мышцах моллюсков (Vibert et al., 1993). Этот высокомолекулярный белок ( молекуляр. масса 530 кДа) относится к тому же иммуноглобулиновому семейству, что и гигантский белок титин у позвоночных животных. Тесная связь между фосфори-лированным состоянием твитчина в гладких мышцах и присутствием или отсутствием "catch"-состояния показана Сиегманом с коллегами (Sieg-man et al., 1997, 1998). Высказаны предположения, что твитчин регулирует "catch''-состояние, взаимодействуя с миозином (Butler et al., 1998) или актином (Shelud'ko et al., 2004а).
Цель данной работы - проследить за последовательностью событий, приводящих к смене типов мышц в онтогенезе мидии Mytilus trossulus, и понять роль твитчина на ранних стадиях развития мидии. Непрямая иммунофлуоресценция с помощью поликлональных антител против твитчина и флуоресцентно меченный родамином фаллоидин как маркер актиновых филаментов были использованы для контроля изменений формирующихся мышечных систем.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Взрослые моллюски Mytilus trossulus были собраны в заливе Восток Японского моря (июнь 2005-2006 гг.). Перед началом эксперимента животных промывали два-три раза профильтрованной морской водой, подвергнутой ультрафиолетовому облучению. Нерест индуцировали термошоком (с 10 до 20°С). Эмбрионы выращивали в аквариумах при температуре 17-18°С в климатической камере. Материал собирали на стадии оплодотворенных яйцеклеток, бластулы (12 ч после оплодотворения), ранней и поздней трохофоры (17 и 36 ч), раннего, среднего и позднего велигера (57 ч; 4, 6 и 8 сут). После 56-часового культивирования личинок ежедневно кормили одноклеточными водорослями Isochrysis galbana (100000 клеток/мл). Внешний вид оплодотворенных яйцеклеток, личинок на разных стадиях развития и взрослых моллюсков представлен на рис. 1.
Для выявления локализации твитчина и актина были использованы поликлональные антитела кролика против твитчина и флуоресцентно меченный родамином фаллоидин в качестве маркера актиновых филаментов. Специфичность используемых антител к твитчину была показана ранее (Odintsova et al., 2006). Оплодотворенные яйцеклетки и личинки на разных стадиях развития фиксировали в течение 3 ч при 4°C в 4%-ном параформальдегиде ("Serva", Германия), приготовленном на 0.1 М фосфатном буфере (ФБ), pH 7.4, и трижды промывали холодным ФБ. Материал хранили в ФБ с 0.03%-ным NaN3 при 4°C. Перед фиксацией в среду к личинкам начиная со стадии велигера (57 ч) постепенно добавляли
7.5%-ный MgCl2 для расслабления ретракторных мышц и раскрытия створок раковины. Кроме того, перед иммунохимическим анализом эти личинки инкубировали в 5%-ном ЭДТА в течение 30 мин для декальцифицирования раковины, а затем трижды промывали ФБ (по 15 мин). Для удаления неспецифического связывания образцы инкубировали в течение ночи в блокирующем буфере, содержащем 10%-ную козью сыворотку ("Sigma", США), 0.25%-ный сывороточный альбумин, 0.5%-ный Тритон X-100 и 0.03%-ный NaN3. После суточной инкубации (при 10°C) с первыми антителами на твитчин (1 : 200) в блокирующем растворе материал промывали в ФБ три раза по 10 мин. В качестве вторых антител использовали козьи антикроличьи антитела ("ISN", США), меченные ФИТц и разбавленные 1 : 800 в ФБ. Параллельно со вторыми антителами к личинкам добавляли родамин-фаллоидин Allexa Fluor 568 ("Molecular Probes", США) (1 : 800). Инкубацию проводили в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте, затем образцы промывали ФБ три раза по 10 мин и погружали в 60%-ный глицерин на ФБ с 2%-ным пропилгаллатом ("Sigma", США). Флуоресцентную микроскопию проводили на микроскопе Axioplan ('^arl Zeiss", Германия), оборудованном стандартным набором фильтров. Было протестировано не менее 100 эмбрионов на каждой стадии развития. В контрольных препаратах, инкубированных только со вторыми антителами, специфической окраски не наблюдали ни на одной из стадий.
Используемая система регистрации сократительной активности описана нами ранее (Карпенко, 1993; Karpenko, Odintsova, 1996). Экспериментальная установка состояла из системы жизнеобеспечения, экспериментальной камеры, микроскопа, видеокамеры и видеомагнитофона. Полученные видеозаписи анализировали с помощью устройства регистрации и первичной обработки сигналов "Cilia-03".
РЕЗУЛЬТАТЫ
Изменения формирующейся мышечной системы личинок мидии были проанализированы с помощью флуоресцентной микроскопии (рис. 2, вклейка). На ранних стадиях развития (яйцеклетка, бластула, ранняя трохофора) окраска поликлональными антителами на твитчин и флуоресцентно меченный родамином фаллоидин Allexa Fluor 568 носила диффузный характер (рис. 2, а, г). Первые оформленные мышечные структуры были обнаружены только на стадии поздней трохофоры (36 ч после оплодотворения) (рис. 2, б, д). Обращает на себя внимание тот факт, что во многих случаях картина расположения актиновых филаментов и твитчина в сократительных системах личинок разных стадий развития сходна. На стадии раннего велигера (57 ч развития) уже вид-
Рис. 1. Некоторые стадии онтогенеза мидии Mytilus trossulus: а - оплодотворенная яйцеклетка; б - стадия бластулы (12 ч после оплодотворения); в - поздняя трохофора (36 ч); г - ранний велигер (57 ч); д - средний велигер (4 сут); е -поздний велигер (8 сут); ж - взрослые моллюски. Масштаб: 50 мкм.
»JwjL .
/.йвйг i^fc. ■ ■ з
* < - Фтш
■ * Л «ЛИ
• - wfiiW^iÄM
и^ *" ч' л. . , I > ъ> > А«л
' * r.VjCtSff М'Л
■ Ш f
д
х
1
^ж
ны 5 пар ретракторных мышц (рис. 2, в, е). Позже, начиная со стадии среднего велигера (4-6 сут), наблюдается исчерченность мышечных структур (рис. 2, к, л), отсутствующая в гладких мышцах взрослых мидий, которая обнаруживается и на стадии позднего велигера (8 сут развития) (рис. 2, м). На этой стадии четко видно, что ретракторы паруса, прикрепленные в районе замка каждой створки с одной стороны, сильно ветвятся в точках прикрепления. На рис. 3 представлены поперечно-полосатая исчерченность личиночных мышц мидии и фраг
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.