научная статья по теме РАЗВИТИЕ PORPHYRIDIUM PURPUREUM (BORY DE SAINT-VINCENT, 1797) DREW ET ROSS, 1965 (RHODOPHYTA) ИЗ АМУРСКОГО ЗАЛИВА ЯПОНСКОГО МОРЯ В ЛАБОРАТОРНОЙ КУЛЬТУРЕ Биология

Текст научной статьи на тему «РАЗВИТИЕ PORPHYRIDIUM PURPUREUM (BORY DE SAINT-VINCENT, 1797) DREW ET ROSS, 1965 (RHODOPHYTA) ИЗ АМУРСКОГО ЗАЛИВА ЯПОНСКОГО МОРЯ В ЛАБОРАТОРНОЙ КУЛЬТУРЕ»

БИОЛОГИЯ МОРЯ, 2014, том 40, № 5, с. 384-390

582.274.2:581.5 АЛЬГОЛОГИЯ

РАЗВИТИЕ PORPHYRIDIUM PURPUREUM (BORY DE SAINT-VINCENT, 1797) DREW ЕТ ROSS, 1965 (RHODOPHYTA) ИЗ АМУРСКОГО ЗАЛИВА ЯПОНСКОГО МОРЯ В ЛАБОРАТОРНОЙ КУЛЬТУРЕ1

© 2014 г. Н. А. Айздайчер1, И. В. Стоник1, А. В. Борода1'2

'Институт биологии моря им.А.В.ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690041;

2Дальневосточный федеральныйуниверситет, Владивосток 690950 e-mail: innast@imb.dvo.ru

Статья принята к печати 6.02.2014 г.

Изучены особенности роста в культуре микроскопической красной водоросли Porphyridium purpureum на разных питательных средах и при разной солености воды. Исследована способность вида к восстановлению после криоконсервации. Показано, что скорость роста и время генерации P. purpureum на экспоненциальной стадии существенно не различались при выращивании на среде/ и среде Гольдберга. Установлено, что вид устойчив к изменению солености в диапазоне от 8 до 32%о. Криоконсервация клеток P. purpureum при использовании трехступенчатого режима замораживания с применением трегалозы в качестве криопротектора показала, что динамика плотности клеток после оттаивания незначительно отличалась от таковой в контроле.

Ключевые слова: Porphyridium purpureum, лабораторная культура, соленость, криоконсервация.

The development of Porphyridium purpureum (Bory de Saint-Vincent, 1797) Drew et Ross, 1965 (Rhodophyta) from Amursky Bay, Sea of Japan, in a laboratory culture. N.A.Aizdaicher1,1. V. Stonik1,A. V. Boroda1-2 ('A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041; 2Far Eastern Federal University, Vladivostok 690950)

This paper examines the peculiarities of growth in culture of the red microalga Porphyridium purpureum on different media and at different water salinity. The ability of this species to recover after cryopreservation was studied. The growth rates and generation time of P. purpureum at the exponential stage were not substantially different between algae cultured on 'f medium and Goldberg's medium. The growth dynamics were stable at salinity ranging from 8 to 32%o. Cell cryopreservation experiments using a three-step freezing procedure and trehalose as the cryoprotectant showed that the cell growth dynamics of Л purpureum after thawing differed insignificantly from those of the control. (Biologiya Morya, 2014, vol. 40, no. 5, pp. 384-390).

Keywords: Porphyridium purpureum, laboratory culture, salinity, cryopreservation.

Одноклеточные микроводоросли рода Porphyridium являются примитивными представителями класса Bangiophyceae (Rhodophyta). Вид Porphyridium purpureum (Bory de Saint-Vincent, 1797) Drew et Ross, 1965 [синонимы Porphyridium cruentum (Gray) Nägeli, 1849 и P. marinum Kylin, 1937] представляет интерес как продуцент редко встречающихся в биологических объектах полиненасыщенных жирных кислот (арахидоно-вой и эйкозапентаеновой) - предшественников проста-гландинов и гельобразующих полисахаридов (Ackman et al., 1968; Ramus, 1972; Ramus, Groves, 1972; Ahern et al., 1983; Vonshak, 1988; Юрьева, 1988; Рудик, Чепой, 2001). Высокое разнообразие жирных кислот и фикобилинов, а также относительно простая методика культивирования порфиридиума делают его интересным объектом для исследования роли пигментов в фотосинтезе и липидов в формировании фотосинтетического аппарата (Ефремова, 2009; Гудвилович, 2010). В связи с этим большое вни-

мание в научной литературе уделяется биотехнологическим и биохимическим аспектам изучения порфиридиума (Ahern et al., 1983; Minkova et al., 1996; Fuentes et al., 2000; Гудвилович, 2010, и др.). В ряде публикаций анализируется влияние условий культивирования на рост Р. purpureum и предлагаются надежные способы его криоконсервации (Golueke, Oswald, 1962; Темных и др., 1984; Rhodes et al., 2006). Криоконсервация очень важна для длительного сохранения культур водорослей, что позволяет избежать изменений, вызванных их постоянным пересевом, возможной контаминацией и дрейфом генов (Ben-Amotz, Gilboa, 1980; Day, 1998; Benson, 2008). Были предприняты попытки замораживания водорослей рода Porphyridium (Leibo, Jones, 1963; Taylor, Fletcher, 1999; Rhodes et al., 2006), однако полученные данные о влиянии разных режимов криоконсервации и криопро-текгоров на рост водорослей в лабораторных культурах достаточно противоречивы.

1 Работа выполнена при финансовой поддержке грантов ДВО РАН (№ 12-1-П30-09, 12-1-0-02-020, 12-1-П4-02 и 12-1-П28-03) и РФФИ-ДВФУ

(№ 12-04-13006-12/13).

В связи с этим цели нашего исследования - изучение особенностей роста красной водоросли Р. purpureum в лабораторной культуре, изолированной из вод Японского моря, на разных питательных средах при разной солености воды, и определение способности ее клеток к восстановлению после криоконсервации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культура Porphyridium purpureum была изолирована из пробы морской воды, отобранной в октябре 2012 г. в Амурском заливе с поверхностного горизонта (0-0.5 м). Соленость морской воды составляла 32.6%о, температура - 10-11°С. При выделении водоросли в клоновую культуру были использованы ранее опубликованные методические разработки (Ланская, 1971; Guillará, 1975; Орлова и др., 2011). Для выделения редко встречающегося вида сначала получали смешанную культуру. Для этого 50 мл морской воды из пробы смешивали с 50 мл питательной среды / (Guillará, 1975), тщательно перемешивали, разливали по стерильным чашкам Петри диаметром 6 см и помещали в шкаф для выращивания культур микроводорослей. Через 15 сут в одной из чашек со смешанной культурой были обнаружены клетки Р. purpureum. Капиллярной пипеткой отбирали одну клетку, отмывали ее в стерильной морской воде и переносили в питательную среду / Клоновую культуру Р. purpureum в жизнеспособном состоянии поддерживали путем периодических (через 10-14 сут) пересевов на свежую среду в стандартных условиях при температуре 20 ± 2°С, интенсивности светового потока 3500 лк на поверхности колб и при режиме освещения 12 ч свет : 12 ч темнота. Для получения синхронной культуры такой режим был постоянным (Fabregas et al., 1985).

Динамику роста Р. purpureum помимо среды / изучали также на среде Гольдберга в модификации Кабановой (1961). Для сравнения динамики плотности клеток при выращивании на двух средах в конические колбы Эрленмейера помещали по 100 мл этих питательных сред и в каждую колбу добавляли суспензию водоросли из соответствующей среды с таким расчетом, чтобы начальная плотность клеток составляла 4 х Ю4 кл/мл. Продолжительность опыта - 14 сут. Через двое суток в одно и то же время из каждой колбы после тщательного перемешивания отбирали пробы для подсчета клеток в единице объема. Клетки подсчитывали в камере Горяева. Материал исследовали и фотографировали, используя световой микроскоп (СМ) Olympus ВХ41 (Япония).

Изменение плотности клеток Р. purpureum в условиях понижения солености морской воды анализировали, выращивая культуру при солености от 4 до 32%о с интервалом в 4%о и дополнительно при 2%о. При таком интервале кривые роста культуры хорошо отражают его зависимость от солености (Джафарова, 1991). За контроль принимали рост водоросли при солености 32%о, т.е. при солености морской воды, близкой к таковой в местах обитания выделенного вида. Для приготовления сред с соленостью ниже контрольной морскую воду разбавляли дистиллированной водой и стерилизовали (Fu, Bell, 2003). Соленость измеряли на солемере ГМ-65М. После этого растворы с различными значениями солености обогащали питательными компонентами среды/(Guillará, 1975). Маточную культуру для инокулята выращивали в стандартных условиях, описанных выше. Инокулят в опытах использовали на экспоненциальной стадии роста. Для получения высокой плотности засевного материала маточную культуру центрифугировали при 900 g в течение 5 мин (центрифуга ОПН-8, ОАО ТНК

"Дастан", Киргизия). Начальная плотность клеток в опытах составляла 4 х 104 кл/мл. Подсчет клеток и отбор образцов проводили, как описано выше. Скорость роста и время генерации определяли по соответствующим формулам (Jones et al., 1963). Средний размер клеток рассчитывали путем измерения 30 клеток при каждой солености.

Влияние замораживания на сохранение жизнеспособности клеток Р. purpureum изучали, используя культуру водоросли на стационарной стадии. Перед замораживанием суспензию клеток разбавляли питательной средой / до концентрации 4-5 X 106 кл/мл. Клетки замораживали до -196°С с использованием проникающих (диметилсульфоксид, этиленгликоль) и непроникающих (трегалоза) криопротекторов при их конечной концентрации 2.5% (об/об) и 20 мг/мл соответственно. Криозащитную смесь готовили на основе стерильной морской воды. Суспензию клеток (0.6 мл) переносили в криопробир-ки объемом 2 мл и добавляли 1.2 мл криозащитной смеси в течение 5-7 мин. Были протестированы одно-, двух- и трехступенчатый режимы замораживания. При одноступенчатом режиме замораживания криопробирки опускали в жидкий азот, при этом скорость охлаждения составляла 90-100°С/мин. Двухступенчатое замораживание проводили сначала в низкотемпературном термостате Proline KP 845 (LAUDA, Германия) до -25°С со скоростью 1-1.3°С/мин в течение 30 мин, затем криопробирки переносили в жидкий азот. Для трехступенчатого замораживания криопробирки сначала охлаждали до -25°С со скоростью 1-1.3°С/мин в течение 30 мин в низкотемпературном термостате. Затем криопробирки помещали на "плотик", плавающий на поверхности жидкого азота, где они охлаждались до -75°С со скоростью 1.8-2.0°С/мин в течение 20 мин, после этого криопробирки замораживали в жидком азоте для хранения. Постоянный контроль температуры осуществляли с помощью регистратора температуры ТС-08 (Omega Engineering, США) с частотой 10 измерений/с.

Через 1-30 сут хранения в жидком азоте криопробирки помещали на водяную баню при 30°С с постоянным перемешиванием. Сразу после оттаивания содержимое крио-пробирок переносили в стерильные пробирки, постепенно разбавляя в 10 раз стерильной морской водой, и осаждали с помощью центрифуги Allegra X-22R (Beckman-C

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком