ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 1, с. 37-45
УДК 577.112:579.861.043:535.31
РЕАКТИВИРУЮЩИЙ ФАКТОР Luteococcus japonicus subsp. casei: ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА
© 2015 г. Л. И. Воробьёва*, Е. А. Рогожин**, Е. Ю. Ходжаев*, И. В. Николаев***, Т. П. Турова****
*Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва 119899 **Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва 117997
***Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва 119071 ****Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва 117312 e-mail: livorobjeva@mail.ru Поступила в редакцию 25.02.2014 г.
Показано, что штамм-продуцент реактивирующего фактора (РФ) по физиолого-биохимическим характеристикам и результатам секвенирования фрагментов 16S рРНК идентичен типовому штамму вида Luteococcus japonicus DSM 10546 семейства Propionibacteriaceae. Ряд фенотипических отличий штамма-продуцента от типового позволяет считать его подвидом вида Luteococcus japonicus и именовать Luteococcus japonicus subsp. casei. При выращивании продуцента РФ секретируется в среду и играет роль сигнальной молекулы. Проявление РФ антиоксидантной активности по отношению к различным типам органических радикалов может быть одним из возможных механизмов реализации его защитного и реактивирующего действия.
Комбинацией методов жидкостной хроматографии проведено разделение метаболитов, выделяемых в культуральную жидкость штаммом-продуцентом L. casei. Показано присутствие 4 компонентов, обладающих биологической активностью. Исследование наиболее активного методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии показало, что он имеет полипептидную природу. Проведена предварительная идентификация некоторых аминокислотных остатков, обнаружено присутствие в данной структуре остатков сахаров.
DOI: 10.7868/S0555109914060166
Микроорганизмы выделяют в окружающую среду ряд функционально активных химических соединений, участвующих в разных процессах жизнедеятельности клетки. Внеклеточные вещества часто обладают полифункциональностью и видовой неспецифичностью [1].
Внеклеточные изомеры и гомологи алкилокси-бензолов, синтезируемые многими организмами, проявляют защитный эффект при стрессорных воздействиях и выступают в качестве сигнальных молекул, активируя экспрессию стрессовых генов
[2]. Кроме того, эти внеклеточные ауторегуляторы контролируют переход микробных клеток в стационарную фазу или образование покоящихся форм
[3]. Другой пример касается действия многих антибиотиков, которые в субингибиторной концентрации индуцируют "кворум сенсинг" — особый тип регуляции экспрессии генов бактерий, зависящий от плотности их популяции [4].
Некоторые, выделяемые клетками соединения, например сигнальные молекулы, участвуют в химической коммуникации на уровне популяций в межвидовом и даже в междоменном взаимодействии [5], что играет важную роль в формировании микробных сообществ и опосредован-
ную роль в повышении устойчивости клеток к стрессам.
Особенности и значение химической коммуникации у бактерий в стрессовых ситуациях на примере штаммов Escherichia coli продемонстрированы и сформулированы в замечательных работах Р. Роубери [6—8]. Однако структура сигнальных молекул, как и механизм их защитного действия оставались за пределами этих исследований.
Ранее нами было показано, что химическая коммуникация при участии внеклеточных соединений с антистрессовым действием свойственна грамположительным, грамотрицательным бактериям, представителям различных видов дрожжей и археям [5, 9]. При этом впервые был продемонстрирован перекрестный эффект экзометаболи-тов прокариот, высших и низших эукариот [5, 10], а также показана их роль не только в защите, но и в реактивации клеток, подвергаемых действию различных стрессорных факторов.
Цель работы — выделение, очистка, идентификация реактивирующего фактора Luteococcus japonicus subsp. casei и изучению его свойств.
МЕТОДИКА
Выращивание бактерий. Реактивирующий фактор (РФ) выделяли из культуральной жидкости (КЖ) ЬШеососсш сазе1. Бактерии выращивали в статических условиях в колбах на 200 мл при 32°С на глюкозо-минеральной среде следующего состава (%): глюкоза — 1.0, ^Н4)2804 — 0.3, КН2Р04 - 0.1, ШН2Р04 - 0.2, Ы§804 - 0.002, СаС12 — 0.002, №С1 — 0.002, дрожжевой экстракт — 0.1, значение рН доводили до 7.0 5%-ным раствором №0Н. Инокулят вносили в количестве, обеспечивающем начальную оптическую плотность 0.4-0.6 (кюветы 3 мл, X = 540 нм, ФЭК 56 ПМ, Россия).
При выращивании бактерий на агаризованной среде в чашках Петри инкубацию проводили в течение 72 ч при 32° С.
Устойчивость к стрессам определяли по численности КОЕ при рассеве аликвот культур в стационарной фазе роста (48 ч) на агаризованную среду вышеприведенного состава, сравнивая с ростом культуры, не подвергнутой стрессу (контроль).
Стрессорные факторы. При изучении стрессор-ных воздействий проводили предварительные эксперименты для установления зависимости "доза-ответ". В качестве стрессорного фактора использовали УФ-облучение. Источником УФ-облучения служила установка из двух параллельно-смонтированных ламп БУВ-15 (Россия) мощностью 30 Вт, основная часть эмиссия которых приходилась на область 253.7 нм. Доза облучения - 81 Дж/м2, при которой выживаемость облучаемых клеток составляла 0.01-0.03%.
Определение протекторной и реактивирующей активности. Для определения активности суспензию клеток до (защитное действие) или после (реактивация) стрессорного воздействия инкубировали с РФ в течение 10 и 15 мин соответственно.
Реактивирующий и (или) защитный эффект оценивали путем сравнения числа КОЕ клеток, выросших в опытном и контрольном вариантах (облученного, но незащищенного). Выживаемость бактерий выражали в процентах по отношению к необлученному контролю. Индекс деления определяли как число клеток, образующих колонии после инкубирования с РФ, по отношению к числу колоний, вырастающих из клеток без пред- или постынкубации.
Определение количества летучих жирных кислот. Хроматографическое разделение и определение количества образуемых бактериями жирных кислот при сбраживании глюкозы проводили на газо-жидкостном хроматографе Кристалл 2000 М ("Хромотек", Россия). Использовали колонку 2В-РЕЛР (15000 мм х 0.32 мм х 0.5 мкм) с нитро-терефталевой кислотой, модифицированной по-
лиэтиленгликолем в градиенте температур 70— 150°C, в качестве носителя.
Определение филогенетического положения штамма. Выделение ДНК из бактерий проводили методом, описанным в работе [11]. Полученные препараты содержали 30—50 мкг/мл ДНК (содержание РНК в препаратах составляло менее 1%). Было получено по два независимых препарата ДНК для каждого из исследованных штаммов.
Для проведения ПЦР и дальнейшего секвени-рования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК использовали универсальную систему праймеров [12]. Состав реакционной смеси включал: прай-меры — по 25 пмоль каждого; 10-кратный буфер для Tag-полимеразы (Taq ДНК-полимераза Dream™) - 2.5 мкл; 2 мМ dNTP - 2.5 мкл; BioTag-полимераза ("Диалат", Москва, 5 Е/мкл) — 0.2 мкл; ДНК-матрица — 50 нг; H2O — 25 мкл. Реакцию проводили по следующей схеме: 30 циклов — 94°C — 0.5 мин; 45°C — 1 мин; 72°C — 1 мин; окончательная полимеризация — 7 мин.
Продукты ПЦР анализировали электрофоре-тически в 2%-ном агарозном геле при напряженности электрического тока 6 В/см. Фотографирование результатов проводили при помощи системы видеодокументации BioDocII ("Biometra", Германия). Выделение и очистку продуктов ПЦР, соответствующих различным областям гена, проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps ("Promega", США) согласно рекомендациям производителя.
Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора реактивов Silver Sequencing ("Promega", США) в соответствии с рекомендациями производителя с незначительными модификациями. Для секвенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры, чтение проводили в двух направлениях.
Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов был проведен с помощью алгоритма BLASTA. Множественное выравнивание с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий осуществляли с помощью программы CLUSTAL W [12]. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [13].
Выделение и идентификация РФ. После выращивания в течение 48 ч на среде, приведенного выше состава, клетки бактерий отделяли центрифугированием при 10000 g 20 мин, дважды промывали 0.05 М Na-фосфатным буферным раствором, рН 7.4, и суспендировали в том же буфере до оптической плотности при 540 нм 0.4—0.6.
Клеточная суспензия служила объектом для стрессорных воздействий, а супернатант (КЖ) использовали как источник РФ. КЖ пропускали че-
рез нитроцеллюлозный мембранный фильтр с порами 0.22 мкм ("Millipore", США), адсорбированные на нем компоненты элюировали 3%-ным раствором NaCl c последующим пропусканием раствора через мембранный фильтр c низким сродством к белку ("Pall", США) для полного удаления клеток. Затем раствор обессоливали методом обращенно-фазовой хроматографии низкого давления на колонке Synchroprep RP-P С8 ("SynChrom Inc.", США) объемом 10 мл. Колонку предварительно уравновешивали 0.1 %-ным раствором три-фторуксусной кислоты (ТФУ). Скорость подвижной фазы составляла около 1.5 мл/мин. После элю-ирования органических солей — компонентов питательной среды и других не связавшихся с колонкой веществ, белково-пептидную фракцию де-сорбировали 70%-ным водным раствором ацето-нитрила в 0.1%-ной ТФУ. Оптическую плотность фракций определяли при 280 нм. Полученные фракции, упаривали в вакуумном концентраторе и высушивали в лиофильной сушке.
Первичное разделение обессоленной КЖ осуществляли методом аффинной хроматографии низкого давления на колонке Heparin HiTrap-Sepharose ("GE HealhCare", Швеция) объемом 5 мл. Лиофильно высушенные фракции с колонки растворяли в 10 мл стартового 10 мМ трис-HCl буфера, рН 7.2, и наносили на предварительно уравновешенную 5 объемами того же
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.