= ОБЗОРЫ
УДК 576.3+577.344+57.043
РЕАКЦИИ НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК РЕЧНОГО РАКА НА ФОТОДИНАМИЧЕСКОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ: СИГНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ, УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ И НЕЙРОГЛИАЛЬНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
© 2013 г. А. Б. Узденский*, А. В. Рудковский, Г. М. Федоренко, Е. В. Бережная, И. А. Ищенко, В. Д. Ковалева, М. А. Командиров, М. А. Негинская, А. М. Хайтин, С. А. Шарифулина
Институт нейрокибернетики, Южный федеральный университет, 344090, Ростов-на-Дону, просп. Стачки, 194/1;
*электронная почта: auzd@yandex.ru Поступила в редакцию 28.04.2013 г.
Фотодинамическая (ФД) терапия, индуцирующая развитие окислительного стресса, используется в терапии рака, включая опухоли головного мозга. Механизмы ФД-повреждения нейронов и гли-альных клеток изучали на простом модельном объекте — изолированном механорецепторе речного рака, состоящем из одиночного сенсорного нейрона, окруженного многослойной глиальной оболочкой. ФД-воздействие вызывало торможение и прекращение активности нейронов, нарушения ультраструктуры внутриклеточных органелл и структур, участвующих в нейроглиальных взаимодействиях, а также биосинтетических, биоэнергетических и транспортных процессов, некроз нейронов и глиальных клеток, апоптоз клеток глии. Смерть нейронов и глиальных клеток регулировалась межклеточными молекулярными посредниками (NO и нейротрофические факторы) и внутриклеточными сигнальными каскадами. Показано, что в ФД-индуцированном торможении и прекращении активности нейронов участвуют ионы Ca2+, высокопроницаемые митохондриальные поры, протеинкиназа C и NO-синтаза. Некрозу нейронов способствовали протеинкиназы B/Akt, GSK-3ß и mTOR, открытие высокопроницаемых митохондриальных пор и путь Са2+/кальмоду-лин/CaMKII. NO и глиальный нейротрофический фактор (GDNF) снижали некроз нейронов. В глиальных клетках сигнальные пути Са2+-зависимой фосфолипазы С, CaMKII, Са2+-зависимой протеинкиназы C, Akt/mTOR, MEK/p38 и протеинкиназы G участвовали в ФД-индуцированном некрозе. Апоптоз клеток глии предотвращался нейротрофическими факторами (фактор роста нервов, NGF, и GDNF), протеинкиназой C и MAP-киназой JNK. Напротив, высокопроницаемые митохондриальные поры и фосфолипаза C, мобилизующие внутриклеточный Ca2+, сигнальный путь NOS/NO/протеинкиназа G, а также белки GSK-3ß и mTOR способствовали ФД-индуцированному апоптозу глиальных клеток. Разработаны схемы участия различных меж- и внутриклеточных сигнальных путей в реакциях нейронов и глиальных клеток на ФД-воздействие.
Ключевые слова: нейрон, глия, внутриклеточная сигнализация, некроз, апоптоз, нейротрофические факторы, нейроглиальные взаимодействия.
Б01: 10.7868/80233475513050216
Выживание, функционирование, дифферен-цировка, пролиферация и смерть клеток регулируются разнообразными "сигнальными" процессами. При этом не только апоптоз, но и некроз, традиционно рассматриваемый как катастрофический, неконтролируемый вид клеточной смерти, регулируются внутриклеточными сигнальными системами [1]. В последние годы накапливаются данные о важной роли ближайшего окружения клетки в ее выживаемости и смерти. Соседние клетки, в частности, нейроны и глиаль-ные клетки (ГК), могут поддерживать выживае-
мость друг друга, обмениваясь различными медиаторами и трофическими факторами [2]. Так, в опытах на изолированном рецепторе растяжения речного рака локальное облучение сенсорного нейрона интенсивным лазерным лучом, сфокусированным на его тело, не только вызывало некроз и нейрона, и соседних ГК в зоне облучения, но также усиливало апоптоз ГК вне облученной зоны, вызываемый последующим фотодинамическим (ФД) воздействием. То есть тело нейрона необходимо для защиты окружающих ГК от апо-птоза [3]. Как осуществляются нейроглиальные
взаимодействия? Один из возможных механизмов — передача сигнальных молекул с последующей инициацией внутриклеточных сигнальных каскадов. К числу потенциальных сигнальных молекул относятся нейротрофические факторы, ней-ромедиаторы и оксид азота (N0).
При ФД-воздействии возбуждение светом молекул красителя-фотосенсибилизатора в присутствии кислорода вызывает интенсивное образование высокотоксичного синглетного кислорода. Синглетный кислород повреждает клеточные белки и мембраны, что приводит к окислительному стрессу и смерти клеток. ФД-терапия используется в онкологии для разрушения опухолей, селективно накапливающих фотосенсибилизаторы [4, 5], в частности, опухолей головного мозга [6, 7]. ФД-воздействие — удобный индуктор дозируемого окислительного стресса, вызывающего некроз или апоптоз, в зависимости от химического строения и концентрации фотосенсибилизатора, интенсивности и продолжительности облучения [5].
В данном обзоре обобщены результаты комплексного электрофизиологического, фармакологического, флуоресцентно- и электронно-микроскопического исследования механизмов ФД-повреждения нейронов и ГК на простом, но информативном модельном объекте — рецепторе растяжения речного рака, состоящем из одиночного механорецепторного нейрона, окруженного ГК. Особое внимание уделено роли нейроглиаль-ных взаимодействий, межклеточных и внутриклеточных сигнальных процессов. Рассмотрены следующие вопросы. Каковы основные мишени ФД-воздействия в клетке? Какой тип клеточной смерти (некроз или апоптоз) вызывает ФД-воз-действие в нейронах и ГК? Какие сигнальные процессы способствуют гибели нейронов и ГК или защищают их от ФД-повреждения?
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В каждом абдоминальном сегменте речного рака расположена пара симметричных мышечных рецепторных органов (МРО). Они состоят из двух рецепторных мышц, растянутых между соседними сегментами. На этих мышцах укреплены быстро и медленно адаптирующиеся механорецепторные нейроны с размером тела до 50—100 мкм, заключенные в многослойную (10—30 слоев) глиальную оболочку (рис. 1). Функциональное состояние нейронов хорошо контролируются по импульсной активности, а окружающие ГК легко идентифицируются. К достоинствам медленно адаптирующихся рецепторных нейронов (МРН) относится их способность генерировать потенциалы действия с почти постоянной частотой в течение нескольких часов после изоляции. Частота им-пульсации МРН пропорциональна удлинению рецепторной мышцы, поэтому, растягивая ее, мы
во всех опытах устанавливали исходный уровень импульсной активности около 6—10 Гц. Нейронную активность отводили внеклеточно от аксонов присасывающейся стеклянной пипеткой, усиливали и регистрировали на персональном компьютере. После выделения МРН и 30-минутной контрольной регистрации импульсной активности в ванночку добавляли алюмофталоцианиновый фотосенсибилизатор фотосенс (10—100 нМ), еще через 30 мин клетки облучали в течение 30 мин гелий-неоновым (633 нм, 0.3 Вт/см2) или диодным (670 нм, 0.4 Вт/см2) лазерами до необратимого прекращения импульсации. Нейротрофические факторы, ингибиторы или активаторы ферментов добавляли за 5 или 25 мин до облучения. Для визуализации мертвых клеток через 8 ч после облучения препарат окрашивали йодидом пропи-дия, не проникающим через мембрану живой клетки и придающим красную флуоресценцию ядрам некротических клеток с поврежденной плазматической мембраной (рис. 1, 3). Другой флуорохром Hoechst 33 342 придает зелено-голубую флуоресценцию ядерному хроматину. Фрагментация клеточных ядер свидетельствовала об апоптозе. Для электронно-микроскопического исследования в определенные моменты реакции нейронов на ФД-воздействие препараты фиксировали глутаровым альдегидом, обрабатывали тетраоксидом осмия и уранилацетатом, обезвоживали в спиртах и ацетоне и заключали в эпон. Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Leica EM UC6 (Leica, ФРГ), исследовали на электронном микроскопе Tecnai G2 Spirit Bio TWIN (FEI, Нидерланды). Эти методы подробно описаны в работах [8—14].
УЛЬТРАСТРУКТУРА МЕХАНОРЕЦЕПТОРНЫХ НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК
Тело МРН содержит многочисленные орга-неллы и рибосомы, что указывает на интенсивный обмен веществ и высокий уровень синтеза белка. Аксоны и дендриты, заполнены микротрубочками, участвующими в транспорте белков. Пучки микротрубочек разделяют перикарион на тельца Ниссля размером 2—5 мкм, содержащие множество цистерн эндоплазматического рети-кулума (ЭР), рибосом и полисом, синтезирующих белки, митохондрий, поставляющих энергию, и диктиосом, участвующих в процессинге, сортировке и подготовке белков к транспорту. Диктио-сомы, как правило, ориентированы выходной транс-стороной к пучкам микротрубочек, что сокращает дистанцию переноса белков от мест синтеза к местам транспорта (рис. 2). Глиальная оболочка МРН состоит из 10—30 слоев, разделенных слоями коллагена. Ядра ГК плоские и удлиненные. Они значительно меньше ядер МРН и содер-
г
Рис. 1. Медленно адаптирующийся рецептор растяжения рака. а — Микрофотография рецептора растяжения в проходящем свете. Флуоресцентные изображения рецептора растяжения (б) и фрагмента его аксона (в), флуорохромирован-ного Hoechst 33342 (сине-зеленая флуоресценция) и иодидом пропидия (красная флуоресценция клеточных ядер). г — Схематическое изображение препарата. Механорецепторный нейрон, окруженный глиальными клетками, прикреплен к рецепторной мышце (РМ). Его аксон и дендриты заполнены многочисленными микротрубочками (МТ). Дендритные окончания (ДО) разветвляются между мышечных волокон. Аф.А — афферентные аксоны, Я — ядро нейрона, Яш — ядрышко. Масштабный отрезок на части б — 50 мкм [8].
жат большие плотные массы сконденсированного гетерохроматина, тогда как ядро МРН содержит в основном деконденсированный эухроматин, участвующий в биосинтетических процессах. В цитоплазме ГК органелл и рибосом гораздо меньше, чем в МРН (рис. 2) [8, 9].
ГК и нейроны обмениваются ионами, метаболитами, нейромедиаторами и нейротрофинами [10]. Малые сигнальные молекулы диффундируют через узкое межклеточное пространство [8]. Большие массы глиальной цитоплазмы переносятся в нейрон в результате захвата верхушек глиаль-ных выпячиваний в цитоплазму нейрона и образования двухмембранных пузырьков. В их формировании участвуют уплощенные субмембранные цистерны на внутренней стороне нейрональной мембраны, которые потом остаются свя
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.