m
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 5, с. 365 - 375
УДК 577 113.4
РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ФОСФОТИОАТНЫХ АНАЛОГОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ. I. СЕЛЕКТИВНАЯ АКТИВАЦИЯ КОНЦЕВЫХ ФОСФАТОВ
И ПОЛУЧЕНИЕ ФОСФАМИДНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФОСФОТИОАТНЫХ АНАЛОГОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ
© 1995 г. Н. В. Амирханов, В. Ф. За рыто ва
Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, 630090, Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8 Поступила л редакцию 20.05.94 г.
С использованием окислительно-восстановительной пары трифеиилфосфин-дипиридилдисульфид осуществлена селективная активация концевых фосфатов олигонуклеотидных аналогов, содержащих межнуклеотидные фосфотиоатные группы (рк), что легло в основу нового способа синтеза различных производных фосфотиоатных аналогов о л игонуклеотидо в. Предложенным способом получены цвиттер-ионные З'-фосфамидные производные ди- и тринуклеотидфосфотиоатов ТрхТр и ТрзТркТр, содержащие остаток 4-диметиламинопиридина или N мгтнлимида юла. Полученные цвиттер-ионные производные реагируют с аминами с образованием в течение 5-10 мин соответствующих З'-фосфамидов практически количественно и без повреждения межнуклеотидных фосфотиоатных групп. Предложенным способом получены также алкилирующие производные фосфо-тиоатов Тр5Тр(№;СН3)СН2КС1) и ТркТр яТр (N (С Н 3) СН2ЯС1) (КС1 = -С6П4^;СН3)СН2СН2С1). Показано, что в ходе синтеза в ОМР межнуклеотидньге фосфотиоатные остатки исследуемых ФТАО устойчивы. Активность алкилирующих 11С1-груш1 в полученных соединениях сохраняется и составляет 85 - 90%.
Ключевые слова: фосфотиоатные аналоги, олигонуклеотиды, трифенилфосфин-дипиридилди-сулъфид, З'-фосфамиды, спектроскопия. 3'Р-ЯМР.
Фосфотиоатные аналоги олигонуклеотидов (ФТАО) нашли широкое применение в качестве антисенсовых последовательностей для подавления жизнедеятельности различных РНК-вирусои как in \ ] ! го. гак и in vivo [1 -5].
Преимущество ФТАО по сравнению с обычными природными олигонуклеотидами заключается в нх устойчивости к действию клеточных иуклеаз [б), а по сравнению с метилфосфонатны-ми аналогами олигонуклеотидов - в хорошей растворимости в водных средах и возможности расщепления РНК РНКазой H в составе двухцепо-чечного комплекса с ФТАО [7].
Для усиления воздействия олигонуклеотидов на генетический аппарат клетки в структуру олигонуклеотидов или их аналогов вводят различные,
Используемые сокращения: ОВП - окислительно-восстановительная пара, ФТАО - фосфотиоатные аналоги олигонуклеотидов, DMTr - днметокситритил, CNEi - 2-циан-эткл. Ру - пиридин. DOX - диоксан, TPS-CI - 2,4,6-триизо-пролилбенюлсульфохлорид, Melm - N-метилнмидазол. DMAP - 4-диыетнламикопирндми. <PyS)2 - 2,2'дипиридил-днеульфид, DMF - диметилформамид, NHiBn - бензил-амин, р» - межнуклеотнднын фосфотноатный остаток. Префикс "d" в обозначении дезоксинуклеотидов опушен.
в том числе и реакционноспособные, группировки, способные стабилизировать комплементарные комплексы (например, интеркалирующие группировки [8 - ]0]), улучшать проникающую способность олигонуклеотидов (например, остатки стероидов [11 - 15]) или повреждать нуклеиновые кислоты (например, алкилирующие, фотоактивные, окислительно-восстановительные группировки [4, 5, 16, 17]).
На сегодняшний день хорошо изучены реакционноспособные производные природных олигопуклеотидов [16, 17], а также производные ФТАО, несущие в своем составе остатки липо-фильных химических групп [12 - 15] или остатки акридина [10].
Различные химические группировки вводятся г, состав ФТАО преимущественно при синтезе последних на полимерном носителе [10, 12 - 15]. Однако такой способ неэффективен для введения ре-акционноспособных или малоустойчивых химических групп, поскольку последние при снятии защит с гетероциклических оснований фосфотио-атов и удаления целевого продукта с полимерного носителя могут менять свою реакционную способность или другие химические свойства.
'ОМТг)Тр(ЗМе) (И)
Тр(5Ме, €N£1)
(Ш)
1. ТР5-С1, Ме1ш
2. N(£1)3
(ОМТг)Тр(8 Ме)Тр(5 Ме)
ЦУа)
I,
(ОМТг)Тр(8Ме)Тр РЬ8И
(DMTr)TpsTp (У1а) Н+
ТрзТр
(1а)
(Уа)
1. (III), ТРБ-О, Ме1т
2. Ы(Е1)3
(ОМТг)Тр(ЗМе)Тр(5Ме)Тр(5Ме) (1Уб) к
(ОМТг)Тр(8Ме)Тр(8Ме)Тр (Уб) | Р1)5Н
(ОМТ^ТрэТрзТр (У1б)
Н+
Tp.sTp.sTp (16)
Схема I.
Возможность применения к ФТАО метода активации концевых фосфатов олигонуклеоти-дов в присутствии окислительно-восстановительной пары (ОВП) - трифенилфосфин (РЬ3Р) - ди-пиридилдисульфид ((Ру5)2) [18], позволяющего манипулировать с уже деблокированными олиго-нуклеотидами и вводить в их состав, например, различные аминопроизводные [9, 11, 16, 18], неясна из-за относительно высокой нуклеофильно-сти межнуклеотидных фосфогиоатных остатков по сравнению с природными фосфатными группами. Это может привести к модификации фос-фотиоатных остатков как самими реакцион-носпособными группами, вводимыми в состав ФТАО, так и ОВП РЬ,Р- (Ру8)2.
Цель настоящего исследования - изучение возможности применения ОВП РЬ,Р-(РуЗ)2 для селективной активации концевых фосфатов оли-гонуклеотидных аналогов, содержащих межнук-леотидные фосфотиоатные группы, а также возможности присоединения различных, в том числе и реакциошюспособпых, групп по концевым фосфатам ФТАО.
Исследования проводили на модельных ди- и тритимидилилфосфотиоатах (1а) и (16),
8 О
и н
сГГМ -0-Р-0-сГПк1-0-Р-ОН
I I
ОН он
(1а)
8 8 О
II II II сЛЪс1 -О- Р-0-(ИЪё -О-Р-О-сГГМ -О-Р-ОН
! I I
ОН он он (16)
содержащих межнуклеотидные фосфотиоатные диэфирные остатки, а на З'-конце - свободную фосфатную группу.
Синтез соединений (1а) и (16) был осуществлен согласно схеме 1.
Вначале по модифицированной триэфирной методике [19] были синтезированы защищенные ди- и тринуклеотидные блоки (ГУа) и (РУб), 5Ме-группу которых с З'-концевого фосфата избирательно удаляли обработкой иодом [19, 20] (20 экв. 12 в водном пиридине, 20 мин, 20°С)*.
Далее удаляли метальные остатки с межнуклеотидных ЗМе-фосфотриэфирных групп обработкой фосфотриэфиров (Уа) и (Уб) тиофенолом [23]. После снятия ОМТг-защитных групп были получены целевые ди- и тринуклеотидфосфотиоаты (1а) и (16). Они были выделены ионообменной ВЭЖХ с выходом 40 - 60% и охарактеризованы с использованием 4 Р-ЯМР-спектроскопии, ионообменной и обращенно-фазовой ВЭЖХ (см. табл. 1 и 2, а также рис. 1а, 4а и 5а). По данным ионообменной хроматографии (см. табл. 2), полученные фосфотиоаты (1а) и (16) имеют большее время удерживания, чем соответствующие контрольные ди- и тринуклеотиды ТрТр и ТрТрТр, не содержащие межнуклеотидных фосфотиоатных групп. При обращенно-фазовой ВЭЖХ продукты элюируются в виде смеси диастереомеров, время
* В первые минуты записи 3|Р-ЯМР-спектра полностью исчезают сигналы в области 18 - 20 м. д., соответствующие концевой фосфодиэфирной 8Ме-группировке, и появляется сигнал в области +0.7 м. д., соответствующий концевому фосфату [21). При этом межнуклеотидные БМе-фосфо-тиотриэфирные защиты не затрагиваются (сигналы в области 28 - 32 м. д. [19, 22]).
Таблица 1, Значения химических сдвигов "Р исследуемых соединений
О ||
Шифр соединений (ТрБУГ-О-Р-Х 0" 8, м. д.*
и X У-Р Р8
(1а) 1 -ОН -0.26 55.63 56.46
(16) 2 » -0.83 -1.18 55.57 56.19
(VII а) 1 -Ы >=1< " \=/ СНз -7.50 -7.57 55.05 55.35
(VI16) 2 » -7.26 55.62 55.84 55.97 56.10
(УШа) 1 -11.45 -11.68 55.09 55.53
(У1П6) 2 » -11.56 55.27 55.34 55.56 55.92
(1Ха) I -N11(С112)31\[Н2 7.65 7.90 55.80 56.86
(1X6) 2 » 7.75 7.88 55.67 56.23 56.80 57.27
(Ха) 1 6.37 6.60 55.90 56.59
(Х1а) 1 СНз _ СНз -И -С.н2-01!, -СН2-01 7.34 7.43 56,37 56.73
(Х1б) 2 » 7.53 7.67 7.79 55.99 56.56 56.98 57.03
* Химические сдвиги даны относительно 85% Н2Р04, растворитель - ОМР.
__JJ
100 ' "80 ^ 60 ' 40 ' 20 ' 0 ' -20 м. д.
Рис. 1.31Р-ЯМР-спектры исходного ТрхТр (1а) (ЫНЕц-соль, 0.01 М раствор в ОМР) (а), реакционной смеси через 4 мин после добавления 10 экв. смеси (РуЗ)2-РЬ3Р (1 : 1) и 20 экв. ОМАР (б) или 20 экв. Ме1т (в).
удерживания которых больше, чем у соответствующих контрольных ди- или тринуклеотидов ТрТр и ТрТрТр. Эти данные подтверждают структуру ди- и тринуклеотидфосфотиоатов (1а) и (16).
Полученные модельные фосфотиоаты (1а) и (16) содержат концевую фосфатную и межнуклеотид-ные фосфотиоатные (ps) остатки, которые резко различаются по значениям их химических сдвигов (примерно на 40 - 60 м. д., см. табл. 1) и в силу этого пригодны для исследования методом 31Р-ЯМР-спектроскопии возможности селективной активации концевой фосфатной группы ФТАО. В качестве активирующего реагента использовали ОВП Ph3P-(PyS)2 в присутствии DMAP или Melm (схема 2). За ходом процесса следили при помощи 31Р-ЯМР-спектроскопии, в случае тринуклеотида (16) - также методом ионообменной хроматографии.
При взаимодействии фосфотиоатов (1а) или (16) с DMAP или Melm в DMF в присутствии смеси Ph3P в (PyS)2, по данным 31Р-ЯМР-спектроскопии, уже в первые минуты записи спектров наблюдается количественное образование DMAP- или Melm-производных ((Vila, б) или (Villa, б) соответственно). Так, например, при взаимодействии динуклеотида (1а), имеющего сигналы концевого фосфата (-0.26 м. д. [18, 21]) и сигналы двух сте-реомеров межнуклеозидфосфотиоатной группы
(5 55.05 и 55.35 м. д. [7]) (рис. 1а)), с DMAP в присутствии ОВП уже при первой записи спектра 31Р-ЯМР (3 - 4 мин) (рис. 16) видно, что в реакцию вступает только концевой фосфат ФТАО. При этом помимо сигналов, относящихся к Ph3P (-5.25 м. д.) и Ph3PO (25.73 м. д.), в спектре регистрируются слабопольные сигналы, характерные для концевого фосфата, несущего остаток DMAP (5 -7.50 и -7.57 м. д. [ 18]) (рис. 16) (отнесение здесь и далее по данным работ [7, 18, 22] и обзора [21]).
При взаимодействии ди- или тринуклеотидов (1а) или (16) с Melm в присутствии смеси Ph3P и (PyS)2 фиксируется появление сигналов в области -11 м. д. (рис. 1в, табл. 1), характерной для Melm-фосф-амидных производных [18], что соответствует образованию соединений (Villa) или (VII16) соответственно. Выдерживание реакционных смесей дополнительно в течение 2 ч, после образования соответствующих цвиттер-ионных DMAP- или Melm-фосфамидных производных, не приводит к появлению в спектрах 31Р-ЯМР каких-ли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.