ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 4, с. 412-416
УДК 577.15:581.1
РЕАКЦИЯ РАСТЕНИЙ Arabidopsis thaliana, ДЕФЕКТНЫХ ПО ЖАСМОНАТНОМУ СИГНАЛИНГУ, НА СОЛЕВОЙ СТРЕСС
© 2015 г. Т. О. Ястреб*, Ю. Е. Колупаев*, Н. В. Швиденко*, А. А. Луговая*, А. П. Дмитриев**
*Харьковский национальный аграрный университет им. В.В. Докучаева, Харьков, 62483 Украина
e-mail: plant_biology@mail.ru **Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАНУкраины, Киев, 03143 Украина
e-mail: dmyt@voliacable.com Поступила в редакцию 19.12.2014 г.
Исследовали влияние экзогенной жасмоновой кислоты (ЖАК) на активность антиоксидантных ферментов в листьях четырехнедельных растений Arabidopsis thaliana L. дикого типа Columbia-0 (Col-0) и мутантов jin1 (jasmonate insensitivel) с нарушенным жасмонатным сигналингом в физиологически нормальных условиях и при действии засоления (200 мМ NaCl, экспозиция 24 ч). Под влиянием ЖАК у растений дикого типа повышалась активность Cu/Zn супероксиддисмутазы, каталазы и гвая-колпероксидазы, а у мутантных растений она не изменялась. В ответ на солевой стресс у растений обоих генотипов активность супероксиддисмутазы существенно не изменялась, активность катала-зы снижалась, а гваяколпероксидазы повышалась. При этом у обработанных ЖАК растений дикого типа, но не у мутантов, активность всех трех ферментов была выше, чем у не обработанных. Засоление вызывало снижение содержания хлорофилла в листьях растений дикого типа и jin1. Предварительная обработка растений Col-0 ЖАК способствовала сохранению нормального содержания фотосинтетических пигментов после солевого стресса, а у мутантов jin1 положительное влияние ЖАК на этот показатель проявлялось слабо. Сделано заключение об участии белка МУС2/Л№как в транс-дукции сигнала жасмоновой кислотой, так и в процессах адаптации растений к солевому стрессу.
Ключевые слова: жасмоновая кислота, сигналинг, белок MYC2/JIN1, антиоксидантные ферменты растений, солевой стресс, адаптация, Arabidopsis thaliana.
DOI: 10.7868/S0555109915040169
Жасмоновая кислота (ЖАК) — фитогормон, участвующий в регуляции устойчивости растений к биотическим (прежде всего некротрофным патогенам и насекомым-вредителям) и некоторым абиотическим стрессорам [1—3]. К настоящему времени установлены участники трансдукции сигнала ЖАК в генетический аппарат клетки. Считается, что ключевым белком жасмонатного сигна-линга является белок С011 (согопаИпе Ш8еп8Шуе1), который участвует в удалении белков-репрессоров факторов траскрипции ЖАК-сигналинга [2, 3]. Белок С011 считается частью убиквитинлигазного комплекса, осуществляющего деградацию белков в 268-протеасоме с помощью убиквитина [4]. Мишенями этого комплекса служат белки (]а8-топа1е-21т-ёотат), выполняющие роль негативных регуляторов ЖАК-сигнализации. Их деградация открывает путь для регуляции с помощью факторов траскрипции экспрессии генов, индуцированных ЖАК. Среди них большое значение имеют факторы транскрипции Л№/МУС2. Показано их участие в формировании защитных реакций от фитофагов и окислительного стресса, а также в метаболизме флавоноидов [5]. Некоторые
факты указывают на возможную роль Л№/МУС2 в адаптации растений к засолению. Так, при действии хлорида натрия у растений винограда отмечалось усиление экспрессии гена ЛМ1/ЫУС2, которое было относительно кратковременным [6]. Авторы полагают, что этот ген прямо не вовлечен в передачу стрессового сигнала, но опосредованно может участвовать в процессах адаптации растений к засолению.
В целом сведений о роли ЖАК в устойчивости растений к абиотическим стрессорам пока недостаточно. Показано, что у растений томатов устойчивого сорта в ответ на засоление среды содержание ЖАК увеличивалось, а у неустойчивого — уменьшалось [7]. В листьях растений ячменя при осмотическом стрессе содержание ЖАК увеличивалось, а при солевом — не изменялось [8].
В то же время в ряде работ установлено положительное влияние экзогенной ЖАК на устойчивость растений к засолению. Так, показано повышение резистентности растений ячменя при действии ме-тилжасмоната, что выражалось в снижении инги-бирования роста и уменьшении накопления ионов натрия в тканях растений [9]. Также экзогенный
РЕАКЦИЯ РАСТЕНИЙ Arabidopsis thaliana
413
метилжасмонат уменьшал вызываемое действием соли усиление экзосмоса электролитов, предотвращал резкие стресс-индуцированные сдвиги в гормональном балансе и ингибирование роста проростков пшеницы [10]. Показано, что в условиях солевого стресса у растений сои экзогенная ЖАК усиливает накопление осмопротекторов (пролина и сахаров) [11].
Отмечено положительное влияние ЖАК и ме-тилжасмоната на устойчивость растений и к ряду других абиотических стрессоров, в частности к действию ультрафиолета (УФ-В, 290-320 нм) [12], тяжелых металлов [13] и гипертермии [14]. Защитное действие ЖАК на растения при абиотических стрессах связано с индуцированием антиокси-дантной системы [14]. Показана роль фактора транскрипции JIN1/MYC2 в устойчивости растений арабидопсиса к окислительному стрессу. Так, в ответ на обработку метилжасмонатом повышалась устойчивость растений дикого типа к окислительному стрессу, вызываемому метилвиологеном, тогда как у мутантов jin1 (jasmonate insensitive1) такого эффекта не наблюдали [15].
Ранее было показано, что у мутантов арабидопсиса jin1 не происходит индуцированной жас-монатом экспрессии гена AtMYC2 [16].
Однако в целом роль фактора транскрипции MYC2 в жасмонат-зависимом индуцировании защитных реакций растений в ответ на абиотические стрессы изучена недостаточно.
Цель работы — исследовать реакции антиокси-датной системы и пигментного комплекса растений арабидопсиса дикого типа (Columbia-0 — Col-0) и мутантаjinl, не чувствительного к ЖАК, в ответ на солевой стресс.
МЕТОДИКА
Исследования проводили на растениях Arabidopsis thaliana L. дикого типа (Col-0) и мутантных линиях jinl, дефектных по гену JIN1, кодирующему белок транскрипт-фактора MYC2/JIN1, участвующий в трансдукции сигнала ЖАК [16]. Семена растений jinl были любезно предоставлены Дж. М. Нейгаузом (Университет Нашатель, Швейцария). Растения в течение 4 недель выращивали в водной культуре на среде Гиба при температуре 24/18°С (день/ночь), освещении 6000 лк и фотопериоде 10 ч [17]. ЖАК ("Sigma", США) вносили в питательную среду и инкубировали в течение 24 ч. В предварительных опытах было установлено, что наиболее существенное влияние на исследуемые показатели ЖАК оказывала в концентрации 10-7 М, а при концентрации 10-8 и 10-6 М оно было менее выраженными (данные не приведены). После инкубации на среде с ЖАК растения переносили на питательную смесь без фитогормона и часть из них подвергали солевому стрессу внесе-
нием 200 мМ №С1 [18]. Через 24 ч инкубации в присутствии №С1 среду заменяли обычной средой Гиба.
Через 1 сут после воздействия ЖАК и через 1 сут после переноса на среду Гиба без ЖАК и (или) с №С1 определяли активность антиокси-дантных ферментов в листьях. Для анализа использовали пластинки зрелых листьев прикорневой розетки. Содержание фотосинтетических пигментов в листьях определяли через 2 сут после окончания инкубации на среде с №С1.
Активность антиоксидантных ферментов определяли по методикам, описанным ранее [14]. Навески листьев (100 мг) гомогенизировали на холоде в 10 мл 0.15 М К,Ма-фосфатного буфера (рН 7.6), содержащего ЭДТА (0.1 мМ) и дитиотрейтол (1 мМ). Для анализа использовали супернатант после центрифугирования гомогената при 8000 g в течение 10 мин при 4°С. Активность цитозольной супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1), представляющей собой Си^п-СОД [19], определяли при рН 7.6, используя метод, основанный на способности фермента конкурировать с тетразолием нитросиним за супероксидные анионы, образующиеся вследствие аэробного взаимодействия НАДН и феназинметасульфата. Активность ката-лазы (КФ 1.11.1.6) анализировали при рН 7.0 по количеству разложившегося пероксида водорода за единицу времени. Активность гваяколпероксидазы (КФ 1.11.1.7) определяли, используя в качестве донора водорода гваякол, в качестве субстрата — пе-роксид водорода. С помощью К,Ма-фосфатного буфера рН реакционной смеси доводили до 6.2.
Фотосинтетические пигменты экстрагировали этанолом и определяли их содержание спектро-фотометрически [20].
Эксперименты проводили независимо 3 раза с трехкратной биологической повторностью. На рисунке и в таблице приведены средние значения и их стандартные ошибки. Достоверность различий между вариантами оценивали по критерию Стьюдента. Обсуждались данные, достоверные прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Активность СОД и каталазы в листьях растений арабидописа дикого типа и мутантов ]1п1 существенно не различалась (рисунок). В то же время активность гваяколпероксидазы у растений ]1п1 была значительно ниже, чем у Со1-0.
Под влиянием ЖАК в листьях растений араби-допсиса дикого типа повышалась активность всех трех изученных антиоксидантных ферментов — СОД, каталазы и гваяколпероксидазы. Увеличение их активности наблюдалось и через 1 сут после переноса растений на среду без ЖАК, хотя при этом активность гваяколпероксидазы немного снижа-
414
ЯСТРЕБ и др.
усл. ед./г мин 250
2
3 4
200 150 100 50
(а)
I
ммоль Н202/г мин
40, ' 2
34
¡ш
35 30 25 20 15
II
(б)
III
1
Л
I
усл. ед./г мин 700 600 500 400 300 200 100
II
(в)
III
г!
I
II
III
Активность СОД (а), каталазы (б) и гваяколперокси-дазы (в) в листьях арабидопсиса через 24 ч после обработки ЖАК (I), переноса на среду Гиба без ЖАК (II) и переноса на среду Гиба с 200 мМ КаС1 (III)
1 - Со1-0 (контроль), 2 - Со1-0 (ЖАК, 10-7 М), 3 -]Ы1 (контроль), 4 -]т1 (ЖАК, 10-7 М).
лась. В листьях мутанта]т1 активность антиокси-дантных ферментов после воздействия ЖАК достоверно не изменялась.
После инкубации на среде, содержавшей №С1, у растений дикого типа активность СОД существенно не изменялась, как в вариантах с обработкой ЖАК, так и без нее, а активность каталазы несколько снижалась. При этом отмечалось значительное (почти двукратное) увеличение активности гваяколпероксидазы (рисунок). Следует отметить, что у растений дикого типа, пр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.