МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 3, с. 420-428
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА =
УДК 576.315
РЕДАКТИРОВАНИЕ ТРАНСКРИПТА ГЕНА сохЗ В МИТОХОНДРИЯХ ДИКОРАСТУЩЕГО ЗЛАКА Б1утш бШпсыб Ь. МОЖЕТ ПРИВОДИТЬ К ОБРАЗОВАНИЮ НОВОГО УЧАСТКА БЕЛОК-БЕЛКОВОГО
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
© 2004 г. Е. Л. Таусон*, Д. С. Вербицкий, Е. С. Клименко, Ю. М. Константинов, М. В. Кулинченко, А. Ш. Арзиев, В. Ф. Кобзев1
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук,
Иркутск, 664033
1Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук,
Новосибирск, 630090 Поступила в редакцию 14.08.2003 г.
С использованием ПЦР, ОТ-ПЦР и прямого секвенирования определена полная нуклеотидная последовательность митохондриального гена и кДНК третьей субъединицы цитохром-с-оксидазы Е1утш sibiricus Ь. (пырейника сибирского). В транскрипте гена сох3 Е. sibiricus обнаружено 12 участков редактирования, изменяющих аминокислотную последовательность конечного белкового продукта. Установлено, что редактирование первичного транскрипта гена сох3 может изменять положение участка белок-белкового взаимодействия. Полученные данные указывают на значимость редактирования мРНК в посттранскрипционной регуляции экспрессии митохондриальных генов растений.
Ключевые слова: злаки, митохондриальные гены, митохондриальные транскрипты, кДНК, редактирование, субъединица 3 цитохром-с-оксидазы, участок сборки.
Митохондриальные транскрипты высших растений подвергаются целому ряду посттранскрипционных модификаций (сплайсинг, процессинг 5'-и 3'-концов, полиаденилирование и редактирование). Важнейшим этапом посттранскрипционных преобразований мтРНК является сайт-специфическое дезаминирование цитидина, или так называемое С —- и-редактирование, которое широко распространено в митохондриях растений, затрагивает практически все митохондриальные мРНК и крайне важно для экспрессии генов, синтеза функциональных полипептидов, стабилизации вторичной структуры интронов и тРНК, а также 3'- и 5'-концевого процессинга тРНК [1, 2].
Как правило транслируются только полностью редактированные транскрипты, а количественное соотношение зрелых мРНК, кодирующих различные субъединицы мультимолекулярных митохондриальных белковых комплексов, регулируется в том числе и посттранскрипционно. В значительной степени это определяется процессом редактирования мРНК [3-5].
Ранее мы обнаружили, что митохондриальные гены гр?13, аХрА, сох1 и сох3 многолетнего дико-
Принятые сокращения: Сох3 - субъединица 3 цитохром-с-ок-сидазы; ПЦР - полимеразная цепная реакция; ОТ-ПЦР - обратная транскрипция с последующей ПЦР; мтРНК/ДНК -митохондриальная РНК/ДНК.
*Эл. почта: tauson@sifibr.irk.ru
растущего злака Е\утш зЫпсш Ь. высокогомологичны этим генам ТгШсит авзТюит. В результате секвенирования геномной нуклеотидной последовательности и кДНК гена сох3 пырейника сибирского установлено, что различия нуклео-тидных последовательностей этого гена у пырейника и пшеницы лежат вне области редактирования транскрипта и приводят к возникновению различий в положениях 53, 230 и 231 аминокислотной последовательности конечного белкового продукта гена сох3 у этих видов [6, 7]. В настоящей работе показано, что редактирование транскрипта сох3 у Е. sibiricus и Т. aвstivum происходит идентичным образом за исключением молчащей модификации И > С, которая присутствует у пшеницы и отсутствует у пырейника. В ходе редактирования происходит 12 конверсий С > И, что приводит к изменению 12 аминокислотных остатков, а также положения и структуры участка белок-белкового взаимодействия в белке Сох3 вследствие изменения положения гидрофобного аминокислотного кластера.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Выделение мтДНК, суммарной мтРНК, получение геномной копии и кДНК гена сохЗ. Митохондрии выделяли из 7-дневных этиолированных проростков Е. sibiricus, как описано ранее [8].
т
ДНК из очищенных митохондрий получали лизисом с детергентом и экстракцией фенолом и хлороформом с последующим осаждением этанолом [9]. Суммарную мтРНК выделяли с использованием гуанидинтиоцианата ("Sigma", США) в лизи-рующем буфере с последующей экстракцией фенолом и хлороформом [10]. Суммарную мтРНК обрабатывали ДНКазой, свободной от РНКазной активности, ("Sigma") из расчета 100 ед.акт./0.5 мг РНК. Препарат мтРНК инкубировали с ДНКазой при 37°С в течение 15 мин [11]. Чистоту мтРНК (отсутствие примеси мтДНК) проверяли амплификацией с соответствующими праймерами, опуская стадию обратной транскрипции. Структуру и размер праймеров для ПЦР подбирали, исходя из данных секвенирования соответствующих генов других растений, представленных в банке данных EMBL. В работе с геном сох3 использовали три праймера: 5'-АТОАГШААТСТСАОАООСА (5'-праймер); 5'-TATACCTCCCCACCAATAGA (З'-праймер) и 5 '-TCCACGTTGGAAGGGC (внутренний праймер). Геномную копию гена сохЗ амп-лифицировали в 50 мкл буфера, содержащего 50 мМ Трис-НС1 (pH 9.0), 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого из dNTP, 20 пМ каждого олиго-нуклеотидного праймера, 2.5 ед.акт. Гад-ДНК-по-лимеразы ("Сибэнзим"). Проводили 35 циклов амплификации (амплификатор модель 109, Коль-цово ООО "БИС-Н") со следующими этапами: денатурация - 94°С, 0.7 мин; отжиг - 50°С, 1.0 мин и полимеризация - 72°С, 1.5 мин, с последующей инкубацией в течение 10 мин при 72°С.
Для синтеза первой цепи кДНК использовали 8 мкл суммарной мтРНК (количество подбирали экспериментально), 3 мкл З'-праймера с исходной концентрацией 20 мкМ и доводили объем до 15 мкл стерильной, свободной от РНКазной активности водой. Пробы прогревали 5-10 мин при 70°С и быстро охлаждали во льду (5 мин), затем в реакционную смесь вносили 5 мкл 5-кратного буфера для синтеза первой цепи кДНК ("Promega"), 1 мкл РНКазина ("Promega") и 1.5 мкл (30 ед.акт.) обратной транскриптазы M-MuLV ("MBI Fermentas"), доводили объем до 25 мкл и инкубировали 60 мин при 37°С. Реакцию останавливали прогревом при 70°С, и микропробирки переносили на лед.
Синтез второй цепи проводили в строгом соответствии с описанием к Universal RiboClone cDNA Synthesis System ("Promega").
Полученную кДНК очищали экстракцией смесью фенола, предварительно насыщенного ТЕ-бу-фером, и хлороформа в соотношении 1 : 1, осаждали двумя объемами этанола, промывали 70%-ным этанолом, высушивали и перерастворяли в 30 мкл бидистиллированной воды. Полученные препараты кДНК использовали для амплификации в стандартных условиях по следующей программе: денатурация - 94°С, 1 мин; отжиг - 45°С, 2 мин; полимеризация - 72°С, 3 мин. Перед амплифика-
Рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов синтеза кДНК с использованием праймеров к гену сохЗ Е1ушия sibiricus. ОТ(-) - Контроль (ПЦР на РНК, не прошедшей стадию обратной транскрипции); ОТ(+) -кДНК гена сохЗ Е. sibiricus. М - маркер длин фрагментов ДНК.
цией пробы прогревали 3 мин при 94°С, после окончания - 10 мин при 72°С.
Для прямого секвенирования продукты амплификации очищали на колонках Wizard ("Promega").
Клонирование геномных копий и кДНК сохЗ. Очищенные продукты амплификации как геномных копий, так и кДНК, использовали либо для клонирования, либо для прямого секвенирования. Клонирование проводили с использованием стандартной высокоэффективной трансформации в штамме Escherichia coli TG2 [12]. Концы продуктов амплификации достраивали в реакции с фрагментом Клёнова ДНК-полимеразы I Е. coli и клонировали в векторе pTZ19U по HindII-сайту.
Секвенирование геномных копий и кДНК гена сохЗ проводили по методу Сенгера [13] с использованием специфических праймеров (структура праймеров приведена выше), без предварительного клонирования. Клонированные кДНК сек-венировали с использованием универсальных праймеров M13/pUC, а также внутреннего праймера для сохЗ. Нуклеотидные последовательности определяли по обеим цепям в трех повторнос-
М1ЕЗ<2КНЗУНЪ¥ОРЗР1л[Р13
1. АТСАТТСААТСТСАСАСССАТТСТТАТСАТТТССТАСАТССААСТССАТССССТАТТТСС 60
2. АТОАТТСААТСТСАСАООСАТТСТТАТСАТТТССТАСАТССААСТССАТССССТАТТТСС 60
СЗЬСАЪАТТУССУМУМНЗЕО 1. 120 2. ССТТСАСТСССАССТТТСССААССАСССТАССАССТСТСАТСТАСАТССАСТСАТТТСАА 120
ССАТЬЬЗЬСЬ1ЕЬЬУТМЕ¥й\1 1. 180 2. СССССТССААСАСТТСТСАСТТТСССССТААТАТТТСТССТТТАТАССАТСТТССТАТСС 180
WRDVLRESTLEGHHTKAVQL 1. 240 2. 240
СРКУС31ЪЕ1¥ЗЕУМЕЬЕАЕ 1. 300 2. 300 ь £ Б;
FWASSHSSLAPTVEIGGIWP 1. 360 2. 360 е Б;
PKGIGVLDPWEIPLLNTPIL 1. 420 2. 420
Ь
РЭ ЗСААУТ1л[АННА1 ЬАСКЕК 1. 480 2. 480 Ъ
КАУУАЪУАТУЗЪАЪУЗТСЕО
1. ССАССАСТТТАСССТТТАСТАССААСССТТТСАСТСССТСТАСТАТССАСТСССТТТСАА 540
2. ССАССАСТТТАСССТТТАСТАССААСССТТТТАСТСССТСТАСТАТТСАСТСССТТТСАА 540
ь Б;
СМЕУУ0АРЗТ13О31УСЗТЕ 1. 600 2. 600
б;
ЕЪАТСЕНСЕНУ11СТЪЕЪ1У 1. 660 2. 660
СС1К<2УЬСНЪТККННУСЕЕА 1. 720 2. 720
AAWYWHFVDVVRLFPFVSIY 1. 780 2. 780
^ Ъ
W W С С I
1. ^^^^^^^АССТАТА 795
2. ^^^^^^^АССТАТА 795
Рис. 2. Сравнение нуклеотидных последовательностей геномного гена и кДНК сох3 Е1ушш sibiricus. 1 - Ген сох3. 2 -кДНК сох3. Жирным выделены участки редактирования мРНК. Подстрочными однобуквенными символами указаны замены аминокислот, вносимые редактированием.
тях. Анализировали не менее трех полученных в независимых экспериментах кДНК.
Продукты секвенирующих реакций разделяли электрофорезом в 5%-ном денатурирующем по-
лиакриламидном геле при напряжении 1500 В. Гели радиоавтографировали в течение 24 ч при комнатной температуре. Параллельно нуклео-тидную последовательность определяли с исполь-
Í.MIESQRHSYHLVDPSPWPISGSLGALATTVGGVMYMHSFQGGATLLSLGLIFLLYTMFVW 6G 2.MIESQRHSYHLVDPSPWPISGSLGALATTVGGVMYMHSFQGGATLLSLGLIFLLYTMFVW60
Í. WRDVLRESTLEGHHTKÄVQLGPiRyGSILFIVSEVMFLFAFFWASSHSSLAPTVEIGGIWP Í2G 2. WRDVLRESTLEGHHTKAVQLGLRYGFILFIVSEVMFFFAFFiVAFFffSSLAPTVEIGGIWP Í2G
1. PKGIGVLDPWEIPLLNTPILPSSGAAVTWAHHAILAGKEKRAVYALVATVSLALVSTGFQ 180
2. PKGIGVLDPWEIPLLNTLILLSSGAAVTWAHHAILAGKEKRAVYALVATVLLALVFTGFQ 180
1. GMEYYQAPSTISDSIYGSTFFLATGFHGFHVIIGTLFLIVCGIRQYLGHLTKKHHVGFEA 240
2. СЬ№ЭТ<2АРРТ13СЗ^СЗТГГЪАТСГНСГНУ11СТЪГЪ1УССШ<^ЪСНЪТККННУСГЕА 240
1. ААУ\таНГ¥0УУКЪГРГУ31У1АМСС1 265
2. ААТТОШГУОУУЮЬГЪРУЗ^ТШСС! 265
Рис. 3. Сравнение аминокислотных последовательностей, полученных при трансляции геномной последовательности (1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.