МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 1, с. 56-68
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА. ^^^^^^ НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 578.221
РЕДОКС-ЗАВИСИМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ИНДУЦИРУЕМЫХ ОКИСЬЮ АЗОТА
© 2004 г. К. Т. Турпаев*, Д. Ю. Литвинов
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991
Поступила в редакцию 03.09.2003 г.
Окись азота - это подвижная и высокореактивная сигнальная молекула, вызывающая в эффектор-ных клетках изменения транскрипции специфических генов. В физиологических условиях NO вступает в реакции с молекулярным кислородом и активными формами кислорода (АФК) с образованием промежуточных соединений, обозначаемых как активные формы азота (АФА). Образование NO и АФК в клетках контролируется гормонами, нейротрансмиттерами, цитокинами и ростовыми факторами. По отношению к ним NO и ее производные действуют как вторичные паракринные факторы, передающие сигнал от клеток, производящих NO, на соседние. Внутриклеточные рецепторы NO и АФА, к которым относятся тирозиновые протеинкиназы семейства Src, G-белок Ras, ци-тохромоксидаза и гуанилатциклаза, - это преимущественно белки, содержащие гем, активные ти-ольные и железосерные группы. Они локализованы и на плазматической мембране, и во внутренних областях клеток. Многие из рецепторов NO являются ключевыми компонентами внутриклеточных регуляторных систем, которые осуществляют контроль над факторами транскрипции AP-1, HIF-1, NF-kB, p53 и экспрессией подчиненных им генов. Характерная особенность NO отличает ее от высокомолекулярных сигнальных молекул: при изменении окислительно-восстановительного потенциала клетки происходит смена рецептора и, тем самым, действие NO направляется на другие объекты. В зависимости от уровня АФК в клетках, под действием NO активируются разные сигнальные системы, что индуцирует (или репрессирует) разное сочетание генов. Обсуждаемые здесь данные выявляют возможность направленного изменения транскрипционного ответа клеток на действие NO при помощи антиоксидантов.
Ключевые слова: оксид азота, активные формы азота, активные формы кислорода, генная регуляция.
Многие метаболические процессы, протекающие в животных клетках, сопровождаются образованием высокореакционноспособных низкомолекулярных соединений, обозначаемых как активные формы кислорода (АФК) и азота (АФА) (см. обзоры [1-4]). В зависимости от типа клеток, синтез АФК может быть или конститутивным, или находящимся под контролем внутриклеточных регуляторных систем. Конститутивный синтез АФК происходит в ходе неизбежных побочных процессов, сопровождающих оксидазные и гидроксилазные реакции, при окислительном фосфорилировании, а также при неэнзиматичес-ком окислении флавинов, гидрохинонов и ряда других органических соединений. В контролируемом синтезе участвуют локализованные на плазматической мембране ферменты, которые обра-
Принятые сокращения: АФА - активные формы азота; АФК - активные формы кислорода; DPTA-NO - дипропи-лентриамин-NONOат; IL-8 - интерлейкин 8, MAP (Mitogen-activated Proteins) - белки, активируемые митогенами; NOS -NO-синтаза; PI3K - фосфатидилинозитол-3-киназа; PKB -протеинкиназа B; PKG - cGMP-зависимая протеинкиназа; PTIO - 2-фенил-4,4,5,5-тетраметилимидазол-1-оксил-3-ок-сид; VEGF - фактор роста эндотелия сосудов. * Эл. почта: turpaev@eimb.relarn.ru
зуют АФК в качестве своего основного продукта: NAD(P)H-oкcидaзы, липоксигеназы и циклоокси-геназа. Активность NAD(P)H-oкcидaз регулируется факторами межклеточной сигнализации: цитокинами, бактериальными эндотоксинами, ростовыми факторами, пептидными гормонами и некоторыми нейротрансмиттерами. В отличие от АФК, синтез NO, единственного предшественника для последующего образования АФА, осуществляют только специализированные ферменты, NO-cинтaзы, которые окисляют аргинин и NADPH с образованием цитруллина и NO. Известны три изофермента NO-cинтaзы, которые кодируются разными генами и различаются по тканевой специфичности, зависимости от кальция и индуцибельности. Конститутивные изофермен-ты, активность которых зависит от уровня кальция в цитоплазме, называют по типу ткани, в которой они были впервые обнаружены. Это два изофермента - нейронная NO-cинтaзa (nNOS) и эпителиальная NO-cинтaзa (eNOS). Изофермент eNOS присутствует только в клетках эпителия кровеносных сосудов, а nNOS содержится во многих тканях, в частности, в скелетных мышцах, миокарде, нейтрофилах, островковых клетках под-
Реакции N0, приводящие к образованию АФА
Молекулы и группы, реагирующие с N0 и АФА
Белки-мишени N0 и АФА
пероксильные радикалы липидов Ь-ОО- ... антиоксидантное действие N0
^ железо в гем-содержащих белках вОС, цитохромы, гемоглобин, миоглобин
железо-серные и цинк-содержащие белки Ш.Р-1, 15-липоксигеназа, Бр1, ЕОЯ-1
тирозированные Р остатки в белках РКА, РКСе, р608ГС
тиильные радикалы Я-Б- к тиольные остатки в белках: окисление тиольные остатки 'в белках: нитрозация каспаза-3, р50 (субъединица NF-кВ), р21ы, HIF-1a
Рис. 1. Основные пути образования и взаимные превращения АФА. Приведены реакции окисления NO с образованием АФА. Показаны химические группы, с которыми реагируют NO и АФА, а также компоненты клеток - объекты действия NO и ее метаболитов. PKA - cAMP-зависимая протеинкиназа, PKCe - протеинкиназа Се, sGC - растворимая гуанилатциклаза.
желудочной железы, эндометрии, дыхательном и желудочном эпителии [5, 6]. В некоторых из перечисленных тканей nNOS ацилирован остатком миристиновой кислоты и локализован на мембране митохондрий [7]. Экспрессия гена (N08 происходит в гепатоцитах, кератиноцитах, макрофагах, клетках дыхательного эпителия, хондроцитах, нейтрофилах, астроцитах и клетках некоторых других типов [5, 6]. Примечательно, что многие внешние стимулы, контролирующие активность NO-синтаз, те же, что определяют уровень образования АФК в клетках: интерфероны, цитокины и пептидные гормоны. Интерфероны и цитокины индуцируют ген /N08, тогда как действие пептидных гормонов, таких как брадикинин, и нейротрансмит-теров, как, например глутамин, повышающих внутриклеточную концентрацию Ca2+, приводит к активации генов nN0S и eN08. Тем самым во многих клетках активация синтеза АФК сопровождается активацией синтеза NO.
МЕТАБОЛИЗМ ОКИСИ АЗОТА
В клетках NO служит источником активных короткоживущих интермедиатов. В реакциях с участием ионов железа и меди это ион нитрозо-ния, NO+, а при окислении NO молекулярным кислородом - азотистый ангидрид N^3 и радикал двуокиси азота, NO . (рис. 1). В отличие от химически достаточно инертной NO, только эти соединения способны модифицировать (через нитрование, нитрозилирование и окисление) белки и пептиды по остаткам цистеина и тирозина [4]. Напротив, только NO способна к образованию нитрозильных комплексов с ионами железа, входящими в состав гемовых и железосерных групп. Окисление NO кислородом и последующий гид-
ролиз образовавшихся продуктов протекают согласно следующим реакциям [8].
2NO + O2
2NO2
• N^4
NO- + Ж)- (1)
NO2 + NO
N^3
2NO2
(2)
Кинетика реакции между NO и O2, в целом, соответствует концентрационной зависимости третьего порядка, а относительно NO - зависимости второго порядка и описывается следующим уравнением: -ЩШ]/Л = k[NO]2[O2], где к = 2.9 х 106 М-2 с1. Время жизни NO в значительной степени зависит от исходных концентраций реагентов. Так, при концентрации кислорода 20 мкМ и исходных концентрациях NO, равных 1 мкМ и 10 нМ (что соответствует диапазону физиологических концентраций), т1/2(NO) в водной среде составляет 6 мин и 10 ч соответственно. В присутствии клеток окисление NO соответствует иной кинетической закономерности и может быть описано уравнением, учитывающим содержание клеток в реакционной среде: = к^Ш^Нклетки], где к^л =
= 5.4 х 10-4М-1с-1(клетки/мл)-1 (измерения проведены на суспензии гепатоцитов) [9]. При плотности гепатоцитов 108 клеток/мл и концентрации кислорода 20 мкМ т1/2(NO) составляет всего 0.65 с. Примечательно, что приведенная выше формула описывает суммарное потребление NO клетками как реакцию первого порядка. Подобная кинетическая зависимость соответствует реакциям NO с гемоглобином (к = 3.7 х 107 М-1с-1) и супероксидом (3.9 х 109 М-1с-1) [10]. Причина быстрого окисления NO в биологических условиях до конца не известна. Значительный вклад в метаболизм NO вносят гем-содержащие белки. В общем виде проходящую в присутствии гемопротеинов (НР)
сР^
& X «Р* х° сГ ^
с/ &
VEGF
Рис. 2. Влияние антиоксидантов на NO-зависимую индукцию гена VEGF в первичных хондроцитах человека. Клетки обрабатывали нитрозоглутатионом (0.5 мМ) в течение 6 ч. Антиоксиданты вносили в культураль-ную среду за 30 мин до нитрозоглутатиона. Восстановленный глутатион использовали в концентрации 5 мМ, N-ацетилцистеин - 20 мМ, каталазу - 500 ед./мл, супероксиддисмутазу - 200 ед./мл. Содержание мРНК определяли методом блот-гибридизации с радиактив-но меченной кДНК гена VEGF. Контроль - необработанные клетки. Кат - каталаза, СОД - супероксиддис-мутаза, GSH - восстановленный глутатион, GSNO -нитрозоглутатион, NAC - N-ацетилцистеин.
,о ,о
х х х * Ci
- .О 0* >Ко"До
,0°
^ ^ С
HOX 1L-8
Рис. 3. Влияние антиоксидантов на NO-зависимую индукцию генов IL-8 и гемоксигеназы 1 в моноцитах U937. Клетки обрабатывали нитрозоглутатионом (0.3 мМ) в течение 4 ч. Антиоксиданты вносили в культуральную среду за 30 мин до нитрозоглутатиона. В качестве ловушки на супероксид и пероксинит-рит использовали мочевую кислоту (1 мМ). В качестве ловушки на (НО^)-подобные радикалы использовали диметилтиомочевину (DMTU, 15 мМ), диметилсуль-фоксид (DMSU, 2%) и формиат натрия (NaHCOO, 1 мМ). N-ацетилцистеин использовали в концентрации 5 мМ, каталазу - 500 ед./мл, супероксиддисмутазу -200 ед./мл. Содержание мРНК определяли методом блот-гибридизации с радиактивно мечеными кДНК, содержащими фрагменты генов IL-8 и гемоксигеназы 1. Контроль - необработанные клетки. HOX - гемокси-геназа 1. Прочие сокращения - см. рис. 2.
реакцию окисления NO кислородом можно представить уравнением:
HP-Fe(II)-O2 + NO —► HP-Fe(III) + NO3
(3)
Образование кислородсодержащих компл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.