МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 637-642
== ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА. ПРОТЕОМИКА
УДК 577.212.3:593.161.13
РЕДУКЦИЯ РЕДАКТИРУЕМОГО ДОМЕНА МИТОХОНДРИАЛЬНОГО ГЕНА А6 (СУБЪЕДИНИЦА 6 АТРазы) У ТРИПАНОСОМАТИД
© 2003 г. А. А. Колесников*, Е. М. Мерзляк, Е. А. Бессолицына, А. В. Федяков, Г. Шониан1
Биологический факультет Московского государственого университета им. М.В. Ломоносова, Москва, 119992 1Institut fuer Mikrobiologie und Hygiene, Charite, Campus Mitte Humboldt Universitate, Berlin, D-10098
Поступила в редакцию 24.01.2003 г.
С целью анализа редукции размера редактируемого домена проведено сравнение нуклеотидной последовательности митохондриального гена А6 (MURF4) у разных видов трипаносоматид. Установлено, что редукция редактируемого домена не столь однозначно связана с филогенетическим положением простейшего, как предполагалось. Показано, что редукция редактируемого домена у моногенетических простейших встречается чаще, чем у дигенетических, и именно у этих видов обнаружен минимальный редактируемый домен гена А6.
Ключевые слова: трипаносоматиды, митохондриальный геном, уридиловое редактирование, ген субъединицы 6 АТРазы.
К отряду Trypanosomatidae относятся простейшие, паразитирующие на беспозвоночных и позвоночных животных и растениях. Trypanosomatidae обладают рядом особенностей структуры и экспрессии ядерного и митохондриального геномов. Так, у них обнаружен уникальный процесс -уридиловое редактирование - посттранскрипционная модификация митохондриальных транс-криптов, которая заключается в матричной вставке и вырезании уридиловых оснований в/из пре-мРНК [1]. В результате этой модификации образуются зрелые транскрипты, которые могут использоваться в качестве матрицы при трансляции [2]. Матрицей для такого рода модификации служат малые РНК - гРНК (гидовые РНК). Показано, что редактирование пре-мРНК происходит в направлении 3' —► 5'. Согласно общепризнанной модели уридиловое редактирование осуществляется в результате последовательного действия ряда ферментов на пре-мРНК/гРНК-дуплекс [3, 4].
Начиная с 1994 г., опубликован ряд работ, в которых нуклеотидные последовательности редактируемых генов трипаносоматид сопоставлены с их филогенетическим положением [5-7]. Оказалось, что митохондриальные гены можно условно разделить на три группы: полностью редактируемые (pan editing genes), частично редактируемые и нередактируемые гены. По результатам сравнения первичных структур гена Аб Д. Маслов и Л. Симпсон предложили модель, по которой в процессе эволюции жгутиконосцев происходила
* Эл. почта: sasha@protein.bio.msu.su
частичная редукция редактирования [6]. Показано, что длина редактируемого домена (РД) уменьшается в ряду: Trypanosoma - пре-мРНК редактируется по всей длине гена (так называемое пан-редактирование); Leishmania - РД пре-мРНК составляет около 100 н.; Herpetomonas muscarum -75 н.; Blastocrithidia culicis (моногенетическое эн-досимбионтсодержащее простейшее) - 35 н. При этом, как следует из сравнения последовательности нуклеотидов гена 18S рРНК, трипаносомы занимают самое нижнее положение, т.е. являются более древними, чем остальные изученные виды.
Такое распределение размеров РД указывает на древнее происхождение редактирования и на постепенную редукцию размера РД в ходе эволюции в более "молодых" группах. На основании этих наблюдений предложена ретропозиционная модель, в соответствии с которой частично отредактированные транскрипты подвергаются обратной транскрипции (ревертазная активность выявлена в лизате митохондрий трипаносоматид). Затем происходит гомологичная рекомбинация с нуклеотидной последовательностью митохондриального генома. Такое уменьшение редактирования приводит к потере необходимости в соответствующей гРНК и, следовательно, в процессе сегрегации митохондриального генома может произойти и потеря миниколец, кодирующих эти гРНК [7].
Предположение об эволюционной древности редактирования представляется крайне интригующим, так как может свидетельствовать о том, что этот процесс - один из наиболее ранних способов регуляции активности генов, корни которо-
LcybF4
ViLeiA6R1
Cyb
A6
Рис. 1. Схема организации изученного района кинето-пластного (митохондриального) генома. Черные прямоугольники - редактируемые области, белые - не-редактируемые. Стрелками обозначены участки отжига праймеров.
го находятся в мире РНК. Следует отметить, что жгутиконосцы (Kinetoplastida) считаются прямыми потомками самых первых представителей эу-кариот [8]. Однако анализ митохондриального генома представителей семейства Bodonidae (которое также входит в отряд Kinetoplastida, но считается предшествующим Trypanosomatidae) показал, что, во-первых, редактирование характерно не для всех членов этого семейства (есть у видов рода Bodo, но отсутствует у Cryptobia). Во-вторых, даже если редактирование происходит, то оно затрагивает меньшее число генов и протяженность РД внутри самого гена несравнимо меньше, чем у трипаносоматид [9]. Таким образом, предполагается, что редактирование возникло в группе бодонид, распространилось и достигло "расцвета" у трипаносоматид [7, 9].
С целью выявления возможной связи между размером РД и филогенетическим положением организма мы определили структуру гена Ä6 у 11 видов простейших, относящихся к семейству трипаносоматид. Полученные данные соотнесены с положением этих организмов на филогенетическом древе, построенном на основе сравнения первичных структур генов 18S рРНК.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Анализировали следующие виды: Crithidia sp. (KV1), C. oncopelti ATCC 12982, Herpetomonas me-gaseliae ATCC 30209, H. pessoai ATCC 30252, Herpetomonas sp. TCC263, Leishmania donovani MHOM/IN/8O/DD8, L. major MHOM/SU/73/5ASKH, L. panamensis MHOM/CR/87/Nel3, Leptomonas col-losoma ATCC 30261, L. seymouri ATCC 30220 и Leptomonas sp. Cfm9.
Простейших культивировали на среде BHI "Difco" (37 г/л среды, pH 7.5), либо на среде STAR [10]. Культуры растили до поздней логарифмической стадии (около 7 сут) при 25°С в воздушном термостате.
Кинетопластную (митохондриальную) ДНК выделяли согласно [10]. Фрагмент гена Ä6, содержащий РД, амплифицировали с помощью полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) с праймерами: LcybF4 -5 '-GCTAGTTGTATGTAGATTAG-3 ' и ViLeiA6R1 -5'-TTGGATCCAT(A/G/T)ATTAA(C/T)TGCATTATC.
Реакцию проводили на амплификаторе "Сус1о-Тетр 5".
РНК выделяли по стандартной методике с использованием гуанидинтиоцианата [11]. Обратную транскрипцию (ОТ) проводили согласно протоколу фирмы-производителя с обратной транс-криптазой М-МЬУ ("Рготе§а", США) и У1Ье1А6Ш в качестве обратного праймера для синтеза кДНК. кДНК амплифицировали аналогично ДНК.
Продукты ПЦР и ОТ-ПЦР секвенировали с использованием набора 'Тто1®" ("Рготе§а", США) или клонировали в Т-вектор рБТ-ВШе 1 ("Коуа§епе"), а затем определяли первичную структуру.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ген Аб клонировали в составе фрагмента, содержащего конец гена СуЬ и большую часть гена Аб. Этот фрагмент амплифицировали с помощью прямого - ЬсуЪР4 (участок отжига в З'-конце гена СуЬ, нередактируемая область), и обратного -У1Ье1А6Ш, праймеров (З'-конец гена Аб, нередактируемая область) (рис. 1) и секвенировали. Проанализировали ген Аб 11 видов трипаносоматид. В выравнивании использовали также полученные из СепВапк последовательности нуклео-тидов гена Аб семи видов. Таким образом, спектр сравниваемых видов оказался достаточно широким и составил 18 видов (рис. 2).
Анализ нуклеотидных последовательностей свидетельствует в пользу того, что ген Аб подвергается 5'-концевому редактированию (рис. 2). Конец РД определяли по появлению открытой рамки считывания, которая обладает протяженной гомологией с уже известными мРНК Аб и не прерывается стоп-кодонами.
Правомочность определения границ РД по выравниванию последовательностей нуклеотидов криптогенов различных видов и уже известных полностью отредактированных мРНК близкородственных видов для одного из изучаемых нами видов, Ь. seymouri, подтверждена экспериментально. Отредактированные продукты гена Аб получали с помощью обратной транскрипции с последующей амплификацией. Следует отметить, что ранее мы показали, что гены СуЬ и Аб считываются и редактируются в составе полицис-тронного транскрипта (Е. Бессолицына, данные не приведены). Локализация участков отжига праймеров в З'-нередактируемых областях гена Аб и гена цитохрома Ь позволила нам использовать У1Ье1А6Ш в реакции обратной транскрипции, а У1Ье1А6Я1 и ЬсуЪР4 для последующей амплификации кДНК и получить продукт, соответствующий полностью отредактированной мРНК гена Аб Ь. seymouri (рис. 2).
о Й
М
я
Я
>
И К О Й о
ч К
г
Crithidia fasciculata, мРНК С. fasciculata
Leptomonas seymouri, мРНК L. seymouri L. sp. Cfm9 Crithidia sp KV1 Herpetomonas muscarum, мРНК H. muscarum H. megaseliae H. pessoai
Blastocrithidia culicis, мРНК
B. culicis
Crithidia oncopelti Herpetomonas sp. TCC263 Leptomonas collosoma
Leishmania tarentolae, мРНК L. tarentolae L. panamensis L. donovani L. major
Crithidia fasciculata, мРНК
C. fasciculata
Leptomonas seymouri, мРНК L. seymouri L. sp. Cfm9 Crithidia sp KV1 Herpetomonas muscarum, мРНК H. muscarum H. megaseliae H. pessoai
Blastocrithidia culicis, мРНК В. culicis
Crithidia oncopelti Herpetomonas sp. TCC263 Leptomonas collosoma
Leishmania tarentolae, мРНК
AU GUUUUUAUUUUUUUUUUGUGAU
AGA G GATT
AU GUUUGUUUUUUUUUUUUGUGAUU
GUUUUUAUUAU
G A ATT
GUUUUAU AUU
GT ATTTATTTTT A GTT A AT
AUGUUUUUUUUUUUUUGUUUUUGUGAU A UUGUAUU UUU
ATTG G AGG AGG
GTGATTT G GATT G GATTTTTG
А G G G GA А G А
А G G G GA А G А
А G G G GA А А G
ACGUAGUUGUAUUUGUAUUAUGUAUAU G GUUUG
ACG AGGA GAAGAA GG G
GCGUUGUUUAAUG AAUUUUGUGUAUAU G GGUUU
GCGTTG AATGTTAA GTGTA ATTTTGTGG GCG G AATG AG A G А A G GG ACG G A TG AG AGAA G GGCC ACGUUGUUUG UUAUGUUUUGUGU AUUGUAGUUUGU G
ACG G G AG GGAGAG GG ACG G G AG GGAGAG GG GCG G A AG GGAG AGTTTGT G
AUCUAG А
А С AG А AUCUAG А
А С AGTTATTTG А С GA А А
AUUU AUGUU GUUUUU
А А G G GUUUUG AUUUUGUUAU
GTA GT А G А А А G
А GA А А AG А А АТА AUC GAAUUGUGUUUUUGUUGUGUAUUUU
А С GAA G G G G G А
А С GAA G G G G G А
АТС GA
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.