СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ, 2013, том 27, № 2, с. 99-107
_ ЗРИТЕЛЬНАЯ _
СИСТЕМA
УДК 612.843.116.1
РЕГЕНЕРАЦИЯ ЗРИТЕЛЬНЫХ ПИГМЕНТОВ В ИЗОЛИРОВАННОЙ СЕТЧАТКЕ ЛЯГУШКИ RANA TEMPORARIA
© 2013 г. Е. Ю. Маурер, В. И. Говардовский
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН 194223 Санкт-Петербург, пр. Тореза, 44 E-mail: vgovardovsky@yahoo.com
Поступила в редакцию 20.12.2012 г.
Мы исследовали регенерацию зрительных пигментов после обесцвечивания в красно- и синечув-ствительных колбочках, стандартных красных (родопсиновых) и зелёных палочках изолированной сетчатки травяных лягушек Rana temporaria. Измерения выполняли при помощи скоростного микроспектрофотометра на интактных одиночных колбочках и палочках, а также на одиночных наружных сегментах палочек. Показано, что красно- и синечувствительные колбочки могут регенерировать зрительный пигмент в изолированной сетчатке, используя путь через глиальные (мюллеровские) клетки. Однако палочки, как красные, так и зелёные, могут регенерировать зрительный пигмент, только если после обесцвечивания сетчатка была опять приведена в контакт с пигментным эпителием, несмотря на то, что первые содержат стандартный палочковый родопсин, а вторые - колбочковый зрительный пигмент. Следовательно, использование того или другого пути регенерации 11-цис хромофора - через клетки пигментного эпителия или глиальные клетки сетчатки - определяется типом фоторецепторной клетки (её морфологическими и, возможно, физиологическими особенностями), а не типом зрительного пигмента, по крайней мере в сетчатке лягушки.
Ключевые слова: колбочки, палочки, зелёные палочки, регенерация, цикл зрительного пигмента, зрительный пигмент
ВВЕДЕНИЕ
Зрительные пигменты состоят из апобелка оп-сина и хромофорной группы, в качестве которой служит обычно 11 -цис ретиналь или 11 -цис 3,4-де-гидроретиналь. Поглощение кванта вызывает изомеризацию 11-цис хромофора в транс-форму. Последующие изменения в опсине приводят к возникновению его активной конформации - ме-тапигмента II, который запускает каскад зрительного возбуждения. В фоторецепторных клетках позвоночных - палочках и колбочках - транс-ретиналь затем диссоциирует от опсина. Соответственно, для восстановления темнового состояния зрительного пигмента необходимо обратное превращение транс-ретиналя в 11-цис ретиналь и рекомбинация последнего с опсином. Обеспечивающая это последовательность реакций называется циклом зрительного пигмента, или
зрительным циклом. Реакции зрительного цикла палочек протекают как внутри самого фоторецептора, так и в прилегающих к сетчатке клетках пигментного эпителия (ПЭ). В наружном сегменте палочки транс-ретиналь восстанавливается в транс-ретинол. Затем транс-ретинол переносится в клетки ПЭ и в серии реакций превращается в 11-цис ретинол. 11-цис ретинол окисляется в 11-цис ретиналь и переносится обратно в наружные сегменты для рекомбинации с опсином (обзор, Lamb, Pugh, 2004).
Относительно недавно были получены данные, показывающие, что фоторецепторы дневного зрения - колбочки - могут использовать для получения 11-цис хромофора альтернативный зрительный цикл, замыкающийся не через ПЭ, а через глиальные клетки сетчатки - мюллеровские волокна (Mata et al., 2002, 2005; Trevino et al., 2005; Munitz et al., 2007, 2009; Schonthaler et al.,
2007; Fleisch, Neuhauss, 2010; Saari, 2012). Было показано, что в богатых колбочками сетчатках имеется собственная (независимая от ПЭ) рети-ноид-изомеразная система, производящая, в частности, 11-цис ретинол (Das et al., 1992; Mata et al., 2005; Trevino et al., 2005; Takahashi et al., 2011). Колбочки могут использовать 11-цис ретинол для регенерации зрительного пигмента (Ala-Laurila et al., 2009; Wang et al., 2009). При этом не исключается, что зрительный пигмент колбочек может параллельно регенерировать и через "классический" палочковый цикл (Cideciyan et al., 2000; Jacobson et al., 2007; Mata et al., 2002; Muniz et al., 2007, 2009). Более того, предполагается, что изомераза может находиться и в самих колбочках (Tang et al., 2011; Znoiko et al., 2002).
Несмотря на значительные усилия, вложенные в исследование колбочко-специфического зрительного цикла, проблема еще далека от разрешения. Так, молекулярная идентичность изомеразы-II, предположительно находящейся в мюллеровских клетках, до сих пор достоверно не установлена (Travis et al., 2010; Wang, Kefalov, 2011; Saari, 2012; Kaylor et al., 2013). Кроме того, изомераза-II исследуется на богатых колбочками сетчатках цыпленка и данио, в то время как единственная прямая демонстрация способности колбочек регенерировать зрительный пигмент без контакта с пигментным эпителием выполнена на колбочках амбистомы Ambystoma tigrinum (Ala-Laurila et al., 2009; Wang et al., 2009). Неясно также, как производимый в сетчатке 11-цис ретинол превращается в 11-цис ретиналь, так как соответствующая 11-цис специфическая ретинолдегидрогеназа в колбочках пока не найдена. Неясен относительный вклад "палочкового" (через ПЭ) и "колбочко-вого" (через сетчатку) пути регенерации в функцию обоих типов рецепторов (последние обзоры, Wang, Kefalov, 2011; Saari, 2012).
В этом отношении представляют интерес необычные "химерные" фоторецепторы - зеленые палочки, имеющиеся в сетчатках многих амфибий. В отличие от стандартных родопсиновых палочек эти клетки содержат синечувствитель-ный (A,max = 430-444 нм) колбочковый зрительный пигмент (Denton, Willie, 1955; Donner, Reuter, 1962; Reuter, 1966; Dartnall, 1967). Они имеют палочковую морфологию и используют палочковые белки фототрансдукции (Ma et al., 2001), но предположительно выполняют в сетчатке колбоч-ковую функцию, выступая в качестве "синего" рецептора для цветового зрения в мезопическом диапазоне освещенностей (Donner, Rushton, 1959; Witkovsky et al., 1981). Ранее электрофизиологи-
ческим методом было найдено, что зеленые палочки лягушки способны регенерировать свой зрительный пигмент в изолированной сетчатке (Goldstein, Wolf, 1973). Однако зеленые палочки амбистомы не могут использовать для регенерации 11-цис ретинол, предположительно поставляемый мюллеровскими волокнами в колбочко-вом цикле (Ala-Laurila et al., 2009).
Таким образом, возникают вопросы, чем определяется использование того или иного пути регенерации зрительного пигмента - типом самого пигмента (палочковый/колбочковый), функцией или морфологией клетки, и не существует ли в этом отношении межвидовых отличий и отличий между спектральными типами колбочек? Насколько результаты, получаемые до сих пор на узком круге объектов, могут использоваться для обобщений?
Мы исследовали регенерацию зрительных пигментов лягушки Rana temporaria в красно- и си-нечувствительных колбочках, зелёных и красных палочках в изолированной сетчатке и в сетчатке, находящейся в контакте с пигментным эпителием, и обнаружили, что только колбочки, но не зелёные или красные палочки способны использовать гли-альный путь генерации 11-цис хромофора, и, следовательно, использование этого пути определяется не типом зрительного пигмента, а морфологией и, возможно, физиологией фоторецептора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследование проводили на фоторецепторах сетчатки травяной лягушки Rana temporaria: красно- и синечувствительных колбочках, стандартных красных (родопсиновых) и "химерных" зелёных палочках. С животными обращались в соответствии с нормами CIOMS (Council for International Organizations of Medical Sciences). Лягушек содержали в холодильнике при температуре +4o С без пищи до нескольких месяцев. В течение суток перед экспериментом животное для адаптации находилось при комнатной температуре, из них последние 12 или более часов - в темноте. При слабом красном свете с длиной волны > 650 нм темноадаптированную лягушку умерщвляли разрушением спинного и головного мозга с последующей декапитацией и вырезали глаза. Все дальнейшие манипуляции проводили в темноте под контролем инфракрасной телевизионной системы. Глаз помещали в физиологический солевой раствор, содержащий 110 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1 мМ СаС!2, 1 мМ MgSO4, 10 мМ
глюкозы, 50 мкМ ЭДТА, 5 мМ №НС03, 10 мМ Ка-НЕРЕБ рН 7.5. Этот раствор использовали при всех процедурах, включая хранение выделенных сетчаток, инкубацию сетчаток для регенерации и приготовление микроспектрофотометрических препаратов. После удаления передней половины глаза и хрусталика сетчатку отделяли от пигментного эпителия.
Выделенную сетчатку делили на три части, соответственно предназначенные: для измерения исходного количества зрительных пигментов в фоторецепторах (темновой контроль); для проверки остаточного количества пигментов сразу после обесцвечивания (контроль обесцвечивания) и для регистрации количества пигментов, регенерировавших в различных типах фоторецепторов после обесцвечивания. Специальный контроль степени обесцвечивания пигментов красных и зеленых палочек был необходим, так как в палочках кратковременное сколь угодно яркое освещение не приводит к полному обесцвечиванию. Долгоживущие промежуточные продукты фотолиза - метапигменты I и III - при повторном поглощении кванта превращаются обратно в исходный пигмент. В результате при интенсивном освещении возникает равновесная смесь продуктов, в которой фоторегенерированный пигмент составляет от 10 до 20% исходного "темнового" (Голобокова и др., 2003; Кокэшкоу е! а1., 2003). В дальнейшем эта фоторегенерированная фракция могла бы быть ошибочно принята за результат биохимической регенерации в темноте, и, следовательно, должна учитываться. В колбочках фоторегенерация неэффективна, и достаточно яркое освещение обесцвечивает весь зрительный пигмент ^о1оЬокоуа, Govardovskii, 2006).
Сетчатку для темнового контроля помещали на хранение при +4 оС на время, в течение которого работали с остальными двумя кусочками сетчатки. Как показывает многолетний опыт работы с фоторецепторами лягушки, такой препарат остается стабильным в течение, как минимум, суток. Кусочки сетчатки, предназначенные для регенерации и контроля обесцвечивания, в течение 10-20 с обесцвечивали белым светом инт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.