ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 1, с. 26-30
УДК 577.158 + 581.19
РЕГУЛИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ ФЕНОЛОКСИДАЗЫ ОКСИДОМ СЕРЫ (IV) - ОСНОВА ПРОИЗВОДСТВА ВЫСОКОКАЧЕСТВЕННОГО
РАСТВОРИМОГО ЗЕЛЕНОГО ЧАЯ
© 2007 г. Н. Т. Омиадзе*, Н. И. Мчедлишвили*, Н. Г. Пруидзе*, Л. К. Гулуа*, М. О. Абутидзе*, К. Ш. Ахвледиани*, Э. Г. Квеситадзе*, В. Р. Аплаков**
*Институт биохимии и биотехнологии им. СВ. Дурмищидзе АН Грузии, Тбилиси, 0159,
email: chai@gol.ge
**Грузинский государственный университет субтропического хозяйства, 4600, Грузия
Поступила в редакцию 29.09.2005 г.
Исследована возможность регулирования активности фенолоксидазы оксидом серы (IV). Установлено, что это соединение в отношении фенолоксидазы характеризуется сильной ингибиторной активностью обратимого и смешанного типа. Ингибиторное действие оксида серы (IV) относительно фенолоксидазы легло в основу создания новой биотехнологии производства растворимого зеленого чая, согласно которой в процессе его получения возрастает выход экстрактивного вещества, содержание фенольных соединений в пересчете на экстрактивное вещество; улучшаются органолепти-ческие характеристики продукции.
В основе многих отраслей пищевой промышленности лежат ферментативные процессы, в которых фенолоксидаза (КФ 1.14.18.1. монофенол, дигид-роксифенилаланин: 02 - оксидоредуктаза) играет важную роль.
Производство традиционных отраслей биотехнологии получения чая, вина, табака и др. полностью определяется окислительными превращениями, протекающими под действием фенолоксидазы [1, 2]. Во время технологической переработки сырья происходит повреждение тканей, нарушается целостность клетки и фенолоксидаза, будучи компартментизированной, т.е. обособленной в ин-тактных клетках, входит в контакт с фенольными соединениями. В результате окисления фенольных соединений у продуктов, подлежащих ферментативной обработке, появляется характерный вкус, аромат и цвет.
Формирование вкуса, аромата и цвета новых видов чая, в частности растворимого, также связано с окислительными превращениями фенольных соединений [3]. Фенолоксидаза является основным ферментом, определяющим скорость и направление этих превращений. Так, если в производстве черного растворимого чая целью технологического просесса является интенсификация окислительных реакций, способствующих образованию вкусовых и ароматических продуктов, а также красных и коричневых пигментов, характерных для настоя черного растворимого чая, то в производстве зеленого растворимого чая окислительные ферментативные процессы рассматривается как явление, ухудшающее качество готового продук-
та. Следовательно, технология производства зеленого растворимого чая ставит задачу довести до минимума протекание окислительных процессов на всех стадиях, чтобы получить чай с зеленым цветом, специфическим вкусом и ароматом. Вместе с тем в зеленом чае почти полностью сохраняется количество катехинов и значительное количество витаминов, содержащихся в исходном сырье, в то время как в черном чае в результате процессов завяливания и ферментации как катехи-ны, так и витамин С в значительной степени под-верждены окислительной деградации. Таким образом, качество и внешный вид чая определяется эффективностью действия фенолоксидазы, что в основном зависит от окислительных превращений внутриклеточных фенольных соединений. Очевидно, для того чтобы добиться требуемого качества продукта, необходимо эффективное и координированное использование этого фермента и регулирование осуществляемых им процессов.
Ранее нами были разработаны методы регулирования активности фенолоксидазы некоторыми природными соединенями [4, 5]. Показано, что с применением этих природных соединений эффективно подавляется остаточная активность фенолоксидазы в процессах пастеризации и хранения некоторых продуктов [6].
Цель работы - установление возможности регулирования активности фенолоксидазы чайного листа оксидом серы (IV) для использования этого ингибитора в технологическом процессе получения зеленого растворимого чая.
мкг/мл
Рис. 1. Зависимость удельной активности фенолокси-
дазы (V, AE/мин мг белка ) от концентрации ингибитора SO2, мкг/мл). Субстрат - пирокатехин.
МЕТОДИКА
Растительное сырье. Растительным материалом служили листья чайного куста Camellia sinensis L., клона "Колхида".
Реактивы. Использовали Твин-80 фирмы "Fe-rak" (Германия), реактив амидо черный ("Reanal", Венгрия), пирокатехин и полиамидный порошок, полученный из объединения "Химреактив" (Россия); пирокатехин предварительно очищали при помощи возгонки в вакууме.
Выделение суммарного препарата фенолоксида-зы из листьев чайного растения. Растительное сырье после тщательного промывания холодной водой и подсушивания измельчали растиранием в жидком азоте. К измельченному материалу добавляли полиамидный порошок в соотношении 1 : 1 по объему и 0.05 М цитратно-фосфатный буфер, pH 6.0, содержащий 0.03 М аскорбиновую кислоту и 0.03 М NaHCO3. Смесь гомогенизировали в течение 3-5 мин. Соотношение измельченного материала к буферной смеси составляла 1 : 15. После этого го-могенат центрифугировали 40 мин при 3000 g. Белки надосадочной жидкости высаливали сернокислым аммонием в интервале 35-95% от насыщения, отделяли и растворяли в дистиллированной воде.
Для полного отделения низкомолекулярных соединений полученный раствор диализовали против дистиллированной воды в течение 24 ч.
Все операции проводили при 4°C.
Белки. Определение проводили с использованием реактива амидо черного [7].
Катехолоксидазная активность. Определяли спектрофотометрическим методом, измеряя поглощение при окислении пирокатехина на СФ-26
V
pH
Рис. 2. Зависимость удельной активности фенолокси-дазы (V, AE/мин мг белка ) от pH. Субстрат - пирокатехин. 1 - без ингибитора, 2 - с добавлением ингибитора (SO2).
("Ломо", Россия) при 420 нм [8]. Измерения проводили против контрольной смеси, содержащей те же компоненты, только вместо ферментного экстракта добавляли соответствующее количество дистиллированной воды.
Влажность. В образцах растворимого чая влажность определяли высушиванием исследуемого продукта при температуре 100-105°С до постоянной массы.
Фенольные соединения и кофеин. Количественное определение содержащихся в растворимом зеленом чае этих соединений проводили по методу [9].
Статистическая обработка данных. Представленные в работе результаты являются средним арифметическим показателем трех измерений. Все вычисления выполнены с помощью Microsoft Excel (Version 4, statistical functions, Microsoft Corp., Redmond, WA, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследована возможность регулирования активности фенолоксидазы оксидом серы (ГУ).Ис-точником оксида серы (IV) служил раствор H2SO3. В реакционной среде концентрация SO2 составляла 0-0.2 мкг/мл (рис. 1), 50%-ное ингибирование активности фенолоксидазы достигалось при концентрации оксида серы (IV), равной 0.035 мкг/мл.
В результате добавления SO2 на фоне общего понижения активности отмечалось отклонение рН в щелочную сторону до 5.6, причем исходный рН-оптимум действия фенолоксидазы составлял 5.3 (рис. 2).
IV 120
100
80
60
40
20
-200
1000 1200 1/И, М-1
Свежие чайные листья
Фильтрация экстракта
Получение водного экстракта
Скручивание-расщепление
Фиксация оксидом серы (IV)
-40 ь
Рис. 3. Зависимость удельной активности фенолокси-дазы (V, АЕ/мин мг белка) от концентрации субстрата - пирокатехин (М), в обратных координатах. 1 - без ингибитора, 2 - с добавлением ингибитора (802).
Для установления типа ингибирования изучена зависимость активности фенолоксидазы от концентрации субстрата (пирокатехин) с ингибитором и без него (рис. 3). Различные значения констант Михаэлиса (Км = 9 мМ и Км = 90 мМ) и максимальной скорости (^акс. = 0.56 АЕ/мин мг белка, Vмакс = 0.34 АЕ/мин мг белка) указывает на сложный, смешанный характер ингибирования.
Из вышеизложенного следует, что сернистый газ обладает сильным ингибирующим действием на фенолоксидазу чайного листа по принципу смешанного обратимого ингибирования.
Экспериментально установленный механизм регулирования активности фенолоксидазы под действием оксида серы (IV) позволил внести определенные изменения в процесс получения полуфабриката зеленого чая.
Существующая производственная технология получения растворимого зеленого чая состоит из 2 этапов: переработка сырья в полуфабрикат и вторичная переработка полуфабриката для получения готового продукта.
Основные процессы получения полуфабриката: фиксация сырья, скручивание-измельчение и сушка. Вторичный процесс представляет собой получение водного экстракта, фильтрации экстракта, концентрирования и дальнейшей сушки до порошкообразного состояния, расфасовывания готового продукта.
Рис. 4 Схема технологии производства растворимого зеленого чая.
При получении полуфабриката зеленого чая особое внимание уделяется такому регламенту фиксации листа, при которой происходит быстрая инактивация фенолоксидазы, т.е. требуется мгновенное предотвращение действия этого фермента, и тем самым, максимальное фиксирование первоначального химического состава зеленого листа. Фиксация чайного листа достигается разными способами: путем его пропаривания или обработки горячим воздухом [3], обжариванием [10], инфракрасным облучением [11] и др. Все эти методы предполагают использование высоких температур, что, естественно, может вызвать нежелательные изменение в химическом составе чайного сырья. Исходя из этого, новая схема предполагает следующие процессы: фиксация сырья оксидом серы (IV), скручивание-расщепление листа, получение водного экстракта, фильтрация, сгущение, сушка, расфасовка (рис. 4).
Применение сернистого газа целесообразно благодаря его быстрому проникновению в ткани чайного сырья и эффективному ингибироварию главного агента, ответственного за окислительные превращения в листьях, фермента - фенолоксидазы.
Химические и органолептические показатели экстрактов растворимого зеленого чая, полученных по новой и производственной технологии
Технология Экстракт, мл/100 г сух. массы Сухое вещество, % Общее количество экстрактивных веществ,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.