УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2012, том 132, № 6, с. 594-600
УДК 577.2
РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФУНКЦИИ АМИНОКИСЛОТ И ИХ СОЧЕТАНИЙ У ПРОКАРИОТ И В ТКАНЯХ ВЫСШИХ ОРГАНИЗМОВ
© 2012 г. Т. Я. Вахитов1, Н. И. Чалисова2, Е. В. Полевая1, Н. С. Линькова3,
В. Х. Хавинсон2,3
ФГУП "Государственный научно-исследовательский институт
особо чистых биопрепаратов " ФМБА, Санкт-Петербург 2Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург 3Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии E-mail:miayy@yandex.ru
Исследовалось действие индивидуальных аминокислот и их сочетаний на рост колоний Escherichia coli О75 и пролиферацию органотипической культуры ткани. Установлено, что все аминокислоты по их действию на размер колоний делились на нейтральные, стимуляторы и ингибиторы роста. Биологический эффект определялся концентрацией аминокислот и зависел от гетерогенности бактериальной популяции. Действие парных сочетаний аминокислот отличалось от действия индивидуальных соединений. Ряд тех же сочетаний аминокислот, которые вызывали эффект в культурах бактерий, были эффективны и в культурах тканей млекопитающих. Показано, что смеси аминокислот, входящих в состав пептидов, дают эффект меньший, чем сам пептид.
Ключевые слова: аминокислоты, пептиды, Escherichia coli, органотипическая культура ткани, регуляция роста.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение механизмов, лежащих в основе регуляции важнейших гомеостатических функций организма, представляет собой одно из приоритетных направлений современной биологии и медицины. Проявление жизни - постоянный процесс обмена веществ и воспроизведения генетической информации с помощью различных регулирующих факторов. Исследование регуляторных механизмов как одноклеточных, так и многоклеточных систем дает возможность понять генез индивидуального развития организмов, механизмы диффе-ренцировки и специализации клеток, принципы регуляции специализированных тканей и воспроизведения генетической информации. За последние десятилетия накопились данные о том, что аминокислоты являются не только пластическим материалом при построении белковых молекул, но сами могут модифицировать экспрессию генов-мишеней и, таким образом, играть роль сигнальных молекул.
Еще в 50-х гг. ХХ в. было обнаружено, что меченные изотопами аминокислоты накапливались
в культивируемых тканях в разной степени - в зависимости от типа ткани (Booth et al., 2005). Установлено, что в культуре ткани слизистой оболочки кишечника, семенников, селезенки, почек ингибирующий эффект нейтральных аминокислот тем больше, чем длиннее их углеводородная боковая цепь. Эффект аминокислот с основными радикалами был различен в разных тканях, а в слизистой оболочке кишечника и семенниках они вызывали угнетение развития. Пролин угнетал развитие ткани коры головного мозга и селезенки (Makinoshima et al., 2002). За последние два десятилетия усилился интерес к изучению влияния кодируемых аминокислот на клеточные процессы. Так, при исследовании показателей специфической и неспецифической резистентности выявлено, что лизин, аргинин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты, триптофан обладают разными иммунно- и фагоцитозстимулирующими и детоксицирующими свойствами (Белокрылов и др., 1995). При исследовании преимплантацион-ных эмбрионов свиней показано, что потребление аминокислот зависит от стадии развития эмбриона (Booth et al., 2005). Имеются данные о влия-
нии аргинина на процессы клеточной пролиферации и апоптоза (Philip et al., 2003). Установлено апоптозиндуцирующее действие аргинина (Kim et al., 2004) в культуре клеток сетчатки постна-тальных крыс. Гладкомышечные клетки сосудов также реагируют на аргинин, увеличивается экспрессия гена fas (Bing et al., 2002; Trulsson et al., 2004). При исследовании аминокислот с разветвленными боковыми цепями выявлено, что лейцин в концентрации вызывал в культуре гепатоцитов крыс усиление синтеза ДНК (Kimura et al., 2005). В ряде работ (Чалисова и др., 2001; Чалисова и др., 2002; Чалисова и др., 2011) было показано, что в культуре тканей различного генеза разные группы аминокислот являются активными, оказывающими стимулирующее или ингибирующее (за счет процессов апоптоза) влияние на клеточную пролиферацию. Выявлено стимулирующее влияние на пролиферацию и ряда коротких пептидов (Хавинсон и др., 2011а; Хавинсон и др., 20116; Khavinson et al., 2005; Anisimov et al., 2011; Fedoreeva et al., 2011) и при сравнительном анализе частоты влияния аминокислот и пептидов на клеточные процессы мы обнаружили (Чали-сова и др., 2007; Чалисова и др., 2011; Fedoreeva et al., 2011), что наиболее эффективны пептиды, в структуре которых присутствуют как стимулирующие, так и ингибирующие данную ткань аминокислоты. За последние годы, в связи с успехами в области молекулярной биологии, были выявлены гены, которые экспрессируются при дефиците аминокислот. Таковыми являются: 1) гены, кодирующие плазма-мембранные транспортеры аминокислот; 2) гены, кодирующие транскрипционные факторы: ATF 3 (активационный транскрипционный фактор), C/EBPa (CCAAT/ enhancer-binding protein), c-jun; 3) гены, кодирующие рибосомальные белки или гены, вовлеченные в сигнальные трансдукционные процессы. Из них наиболее изучены следующие - ген аспа-рагин синтетазы (ASNS), ген ядерного протеина СНОР(C/EBP Homologous Protein) транспортной системы А нейтральных аминокислот, опосредованной продуктами гена SNAT2 (serotonine-N-acetyltransferase), относящийся к семейству транскрипционных факторов C/EBP (Чалисова и др., 2011).
Значительно меньше известно о регуляторных функциях аминокислот в микробных культурах. Хотя и в этом направлении в последние годы получены определенные результаты. Установлено, что аминокислоты по-разному влияют на рост бактерий разных видов и даже штаммов. Так, например, аспарагиновая кислота ингибировала рост E.coli M-17, но при этом являлась стимулятором роста E. coli BL, гистидин ингибировал
рост обеих эшерихий, но не влиял или слабо стимулировал рост S. enteritidis, фенилаланин стимулировал рост E.coli BL, но не влиял на рост E.coli M-17, валин стимулировал рост E.coli M-17, не влиял на рост ряда других штаммов, но ингиби-ровал рост E.coli К-12, триптофан стимулировал рост E.coli BL, но не влиял на рост E.coli M-17 и S. enteritidis (Вахитов и др., 2006). Различия в действии аминокислот на близкородственные штаммы микроорганизмов могут быть связаны с существованием определенных штаммоспецифи-ческих мутаций. Так, ингибирование валином роста E.coli К-12 связано с отсутствием у нее одного из трех ферментов синтазы ацетогидроксикислот (Lawther et al., 1981).
О регуляторном действии аминокислот свидетельствовало их влияние на продукцию холерного энтеротоксина тремя штаммами Vibrio cholerae (cholerae 569В, eltor 1310, cholerae О139 МО45). Оказалось, что токсинообразование у каждого из них определяется индивидуальным набором аминокислот (Овсова и др., 2003). Известны и другие примеры действия сочетаний аминокислот, однако систематическое изучение этого вопроса до сих пор не предпринималось.
Целью настоящей работы являлось изучение действия аминокислот и их сочетаний на рост колоний бактерий и органотипических культур тканей млекопитающих. Можно полагать, что в процессе эволюции подобная регуляция была основой для появления регуляции с использованием более сложных молекул - пептидов и белков.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служила культура бактерий Escherichia coli О75. Культуру микроорганизмов выращивали на глюкозо-минеральной среде М-9 в колбах на качалке до стационарной фазы роста и засевали в чашки Петри с агаризованной средой М-9 с добавками аминокислот в концентрациях 0.5, 5, 50 и 500 мкМ; для некоторых аминокислот - 1000 и 2000 мкМ. Для контроля использовали среду без добавления аминокислот. Засеянные чашки термостатировали при +37 оС в течение 40 часов. Все эксперименты проводили в 3-х кратной повторности.
После инкубации производили подсчет колоний, выросших на чашках. Размер колоний определяли по фотографиям. Чашки фотографировали специализированной видеокамерой МИКС-480, а для анализа изображений использовали программу "ВидеоТесТ - Морфо 3.2". Затем рассчитывали средний диаметр колоний на контрольных чашках и на чашках с добавками аминокислот. Индекс
площади (ИП) рассчитывали в условных единицах, как соотношение площади колоний на чашке с аминокислотами к площади колоний на контрольной чашке. Значения индекса площади выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%. На основании полученных данных делали заключение о действии аминокислот.
Во второй серии эксперименты проведены в органотипической культуре на 800 эксплантатах сердца, селезенки, печени, коры головного мозга половозрелых крыс линии Вистар. Отпрепарированные органы разделяли на фрагменты величиной около 1 мм3, которые помещали в чашки Петри с коллагеновым покрытием дна. Питательная среда состояла из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной телячьей сыворотки и 5% куриного эмбрионального экстракта. В среду добавляли глюкозу (0.6%), инсулин (0.5 ед/мл), гентамицин (100 ед/мл). Исследуемые препараты добавлялись в культуральную среду в концентрациях 0.5-2 мкМ.
В чашки Петри с экспериментальными эксплантатами добавляли 3 мл питательной среды с исследуемой концентрацией аминокислот, в чашки Петри с контрольными эксплантатами - 3 мл питательной среды, таким образом, эксплантаты экспериментальной и контрольной групп развивались в одинаковых объемах питательной среды. Чашки Петри помещали в термостат при температуре 37 оС и через 3 сут. просматривали под фазо-во-контрастным микроскопом. Затем определяли (ИП, который рассчитывался в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата (вместе с зоной выселяющихся клеток) к площади центральной зоны эксплантата. Для визуализации эксплантатов применяли микротеленасадку для микроскопа (серия 10, МТН-13 "Альфа-Телеком", Россия). Для расчета индекса площади эксплантатов использовали программу РИоШМ 1.2. Для каждого исследуемого вещества анализировали 20-25 экспериментальных эксплантатов и 2023 - контрольных. Для статистичес
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.