ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 43, № 3, с. 265-271
УДК: 574:581.4:631.84721:6324
РЕГУЛЯТОРНЫЕ ГЕНЫ ГОРОХА ПОСЕВНОГО (Pisum sativum L.), КОНТРОЛИРУЮЩИЕ РАЗВИТИЕ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ КЛУБЕНЬКОВ И АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ (ОБЗОР)
© 2007 г. А. Ю. Борисов*, А. Г. Васильчиков**, В. А. Ворошилова*, Т. Н. Данилова*, А. И. Жернаков*, В. А. Жуков*, Т. А. Королева*, Е. В. Кузнецова*, Л. Мадсен***, М. Мофетт***, Т. С. Наумкина**, Т. А. Неманкин*, Е. С. Овчинникова*, 3. Б. Павлова*, Н. Э. Петрова******, А. Г. Пинаев*, С. Радутоиу***, С. М. Розов*****, Т. С. Рычагова*, И. И. Соловов**, И. Стоугаард***, А. Ф. Топунов******, Н. Ф. Уиден****, В. Е. Цыганов*,
О. Ю. Штарк*, И. А.Тихонович*
*Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, Россия, Санкт-Петербург, 196608; e-mail: Alexey_Borisov@arriam.spb.ru **Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур РАСХН,
Россия, Орел, 302502; e-mail: Naumkina1@yandex.ru ***Aarhus University, Department of Molecular Biology, DK-8000, AarhusC, Denmark; e-mail: stougaard@mb.au.dk
****Montana State University, Bozeman, Montana, USA; e-mail: nweeden@montana.edu *****Институт цитологии и генетики СО РАН, Россия, Новосибирск, 630090; e-mail: rozov@bionet.nsc.ru ******Институт биохимии им. А Н. Баха РАН, Россия, Москва, 119071; e-mail: topunov@inbi.ras.ru
Поступила в редакцию 11.07.2006 г.
Обобщен многолетний опыт изучения генетической системы гороха посевного (Pisum sativum L.), контролирующей развитие азотфиксирующего симбиоза и арбускулярной микоризы, полученный коллективом авторов и другими исследователями. Представлена обновленная фенотипическая классификация мутантов гороха. Отражены успехи в идентификации и клонировании симбиотиче-ских генов. Продемонстрирована возможность практического использования двойной инокуляции для увеличения продуктивности растений за счет мобилизации потенциала тройной симбиотиче-ской системы: горох - клубеньковые бактерии - грибы арбускулярной микоризы.
Горох посевной имеет значение не только как ценная сельскохозяйственная культура, но и как модель для генетических и физиологических исследований, в том числе в области мутуалистиче-ских растительно-микробных взаимодействий. В процессе эволюции горох приобрел уникальную способность формировать два типа мутуалисти-ческих эндосимбиозов: азотфиксирующий симбиоз (АФС) с клубеньковыми бактериями вида Rhizobium leguminosarum Ьу. viciae и арбускулярную микоризу (АМ) с грибами отдела Glomeromycota [1]. Эта способность дает растению возможность существования в условиях сниженной фертильности почв в обмен на продукты фотосинтеза и экологическую нишу, получаемые микросимбионтом. Симбиозы также предохраняют почвы от истощения и поддерживают биологическое разнообразие растительных сообществ [2-4]. Азотфиксирующий симбиоз и арбускулярная микориза характеризуются высокой степенью интеграции генетических систем партнеров и в значительной степени контролируются растением [5].
Идентификация симбиотических генов гороха, контролирующих формирование азотфиксирующего симбиоза. Анализ генетической изменчивости симбиотических свойств гороха был начат еще Говоровым [6] и Разумовской [7], которые обнаружили, что определенные генотипы гороха из Афганистана (принадлежащего к Центрально-Азиатскому центру происхождения культурных растений) не формируют клубеньков с некоторыми штаммами клубеньковых бактерий из европейских почв, в то время как другие - формируют. Генетический анализ местных афганских образцов, проведенный Ли [8], позволил идентифицировать первые симбиотические (Sym) гены гороха. Широкое применение химического и физического мутагенеза привело к значительному прогрессу в выявлении новых симбиотических генов гороха.
В нескольких лабораториях мира были реализованы программы мутагенеза с использованием различных методик и привлечением разных образцов и линий гороха (см. обзор [9]). К настоящему времени исследователями из разных стран было получено более 250 мутантов гороха [10-
29]. Почти половина этих мутантов была включена в комплементационный анализ, в результате которого было идентифицировано более 40 сим-биотических генов (табл. 1).
Интенсивный морфологический анализ выделенных мутантов показал, что у них блокированы различные стадии развития клубенька [17, 20, 21, 23, 25, 26, 30-38]. На основании результатов собственных исследований коллектива авторов, а также данных, опубликованных в литературе, морфогенез клубенька был подразделен на две подпрограммы развития: (I) колонизации тканей растения и дифференцировки бактерий в симбио-тическую форму (так называемые бактероиды) и (II) развития тканей клубенька (табл. 2). Кроме того, обнаружение новых стадий развития АФС, контролируемых растительными генами [35, 38], определило необходимость дополнения используемой прежде системы фенотипических кодов, описывающих процесс развития симбиотическо-го клубенька [39, 40]. К настоящему моменту определена следующая последовательность программы колонизации: (I) скручивание корневого волоска (Нас), (II) колонизация скрученного корневого волоска (Crh), (III) инициация роста инфекционной нити (Iti), (IV) рост и развитие инфекционной нити в клетке корневого волоска (Ith), (V) рост и развитие инфекционной нити в ткани корня (Itr), (VI) рост и развитие инфекционной нити в ткани молодого клубенька (Itn), (VII) дифференцировка инфекционной капли (Idd), (VIII) дифференцировка бактерий в бактероиды (трансформация бактерий в органеллопо-добные симбиотические формы) (Bad) и (IX) структурно-функциональная стабильность клубеньков (Nop).
Последовательность дифференцировки тканей клубенька была определена следующим образом: (I) деление клеток внутренней коры корня (Ccd), (II) развитие клубенькового примордия (предшественника) (Npd), (III) дифференцировка первичной меристемы клубенька (Pnm), (IV) дифференцировка вторичной меристемы клубенька (Snm).
Идентификация симбиотических генов гороха, контролирующих формирование арбускуляр-ной микоризы. Процесс идентификации генов, вовлеченных в контроль развития арбускулярной микоризы со стороны растения, оказался менее успешным, что связано с особенностями АМ (об-лигатный характер симбиоза, отсутствие сексуального процесса и гетерогенность генома у грибов), а также с отсутствием селективных сред для отбора мутантов с нарушениями развития микоризы [41]. Дюк с соавторами [42] первыми продемонстрировали, что у некоторых генотипов гороха, имеющих нарушения в развитии АФС, также блокирован процесс формирования AM. В результате анализа различных коллекций мутантов
гороха было выявлено, по крайней мере, 3 стадии развития арбускулярной микоризы: (I) рост инфекционной гифы из апрессория и проникновение в корень (Мус1) [43] (или (Pen), согласно [44]), (II) развитие арбускул (Мус2) [41] (или (Arb), согласно [44]), и (Ш) динамика развития AM (Rmd) [45]. Однако данные, полученные в результате анализа развития арбускулярной микоризы у мутантов гороха с нарушениями развития АФС, подтверждают необходимость проведения прямого скрининга мутантов с нарушениями развития AM после экспериментального мутагенеза с целью идентификации генов растений, контролирующих развитие AM.
Определение первичной последовательности и биохимических функций симбиотических генов
гороха. Предполагалось, что гены гороха, идентифицированные в результате экспериментального мутагенеза, являются регуляторными, что и было подтверждено с использованием методов молекулярной генетики у модельных бобовых: лядвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) К. Larsen) и диплоидной люцерны (Medicago truncat-ula Gaertn.). Обнаружение макро- и микросинтении геномов лядвенца, диплоидной люцерны и гороха [46-48] позволило клонировать и секвенировать группы ортологов симбиотических генов бобовых (табл. 3). Клонированные гены гороха кодируют рецепторные киназы (Sym10, Syml9, Sym29, Sym37), кальций/кальмодулинзависимую киназу (Sym9), потенциальный активатор транскрипции (Sym35), регулятор транскрипции (Sym7) и кати-онный канал (Sym8). Также предполагалось, что эти гены регулируют экспрессию бактериальных симбиотических генов, что было подтверждено с использованием ряда симбиотических мутантов [49]. Было показано, что в процессе дифференцировки бактероидов гены бактерий, за исключением непосредственно вовлеченных в процесс фиксации азота, постепенно подавляются в результате взаимодействия с симбиотическими генами гороха [50].
Существование общих генов и молекулярных продуктов, необходимых для формирования обоих симбиозов [41], привело к заключению, что бобовые обладают совместной генетической системой, контролирующей развитие тройного симбиоза (бобовое растение + грибы арбускулярной микоризы + клубеньковые бактерии). Также может быть постулировано, что генетическая система растения, контролирующая развитие АФС, эво-люционно базировалась на системе контроля формирования AM [5, 51]. Этот факт очень важен для использования тройной симбиотической системы в экологически ориентированном адаптивном сельскохозяйственном производстве.
Перспективы использования тройного симбиоза в сельскохозяйственной практике. C привле-
Таблица 1. Симбиотические гены гороха (Pisum sativum L.), идентифицированные в результате изучения формирования корневых клубеньков. (Жирным шрифтом выделены гены с известной нуклеотидной последовательностью. Через запятую перечислены аллельные мутанты. Знаком"=" объединены мутанты, несущие идентичные мутации)
Ген Группа Фенотип Мутантные линии Ссылки
сцепления мутантов
Syml = Sym2 I Nod+/- Л 1357 (типовая линия) [8, 54-57]
Sym3 Fix- Л 1357 (типовая линия) [54]
Sym4 Nod- Л261 [58]
Sym5 I Nod- E2, R88, E77, E111, E143, Е166, Е169, К20а [12, 22, 29]
Sym6 Fix- Л 1357 (типовая линия) [59, 60]
Sym7 III Nod- E69, N12, RisNodl4 [15, 61]
Sym8 = Sym20 VI Nod- Е14, R19, R25, R80, RisNod10, RisNodl3, RisNodl9, [15, 26, 61]
RisNod21, RisNod25, Sprint-2Nod-l, Sprint-2Nod"--2
Sym9 = Sym30 IV Nod- **P1 = P2 = P3, P53 = P54, R72, Ri
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.