РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2008, том 2(11), № 4 с. 427-432
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
РЕГУЛЯТОРНЫЕ Т-ЛИМФОЦИТЫ У ДЕТЕЙ С ТИМОМЕГАЛИЕЙ
© 2008 г. А.Д. Донецкова, М.Ф. Никонова, И.М. Данько, П.Д. Ваганов, О.В. Бурменская, Д.Ю. Трофимов, Л.П. Алексеев, А.А. Ярилин
ГНЦ — Институт иммунологии ФМБА РФ, Москва, Россия;
Российский государственный медицинский университет, Москва, Россия
Поступила: 14.03.08 г. Принята: 25.04.08 г.
У детей первого года жизни с тимомегалией наряду со снижением содержания в крови лимфоцитов, Т-клеток и их хелперной (CD4+) субпопуляции выявлено значимое уменьшение абсолютного и относительного содержания естественных регуляторных клеток (Тгед) с мембранным фенотипом С04 + С025ы, а также экспрессии основного внутриклеточного маркера этих клеток — FOXP3. Выявлена парадоксальная зависимость абсолютной и относительной численности Тгед от выраженности тимомегалии: эти показатели максимально снижены при тимомегалии 1-й степени и не отличаются от контроля при тимомегалии 3-й степени. Выраженность снижения экспрессии FOXP3 не зависит от степени тимомегалии. При тимомегалии усиливается экспрессия генов супрессорных цитокинов TGFp и Ш-10, с которыми частично связана реализация функции Тгед и других регуляторных Т-клеток; усиление максимально выражено при тимомегалии 3-й степени. Регистрируется также усиление экспрессии гена 1Ь-6 — цитокина, подавляющего развитие Тгед. Можно предположить, что снижение содержания Тгед в крови детей раннего возраста с тимомегалией обусловлено общим ослаблением продуктивного Т-лимфопоэза, ослабление экспрессии ЁОХР3 связано с повышением выработки 1Ь-6, а усиление экспрессии генов ТСБр и 1Ь-10 может рассматриваться как компенсаторная реакция системы регуля-торных клеток на низкое содержание Тгед.
Ключевые слова: регуляторные Т-клетки, тимомегалия, БОХР3, ТСБр, !Ь-10
ВВЕДЕНИЕ
Тимомегалия представляет собой недостаточно четко охарактеризованный синдром. Этим термином объединяют различные по своей природе состояния, характеризующиеся увеличением тимуса [1]. Немногочисленные работы, в которых тимомегалия рассматривается с точки зрения патологии лимфоид-ной ткани или иммунной системы в целом мало проясняют проблему [2, 3], и единое мнение относительно природы и клинической значимости тимомегалии до сих пор не сложилось. Высказывались точки зрения, что тимомегалия — проявление аномалий развития иммунной системы, нарушений функциональных взаимосвязей иммунной, нервной и эндокринной систем [4 — 6] и т.д. Не ясно, следует ли рассматривать увеличение размеров
Адрес: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24, к. 2, Институт иммунологии. E-mail: ayarilin1@yahoo.com
тимуса как первичный феномен [7, 8], который отражает дефект развития этого органа, проявляющийся в ослаблении элиминации тимоцитов в процессе селекции, или это — вторичное проявление нарушений эндокринной регуляции тимуса со снижением уровня стероидных гормонов надпочечников [4, 6]. Вероятно, тимомегалия — это гетерогенная группа состояний, которые в одних случаях могут быть трактованы как патология, в других — как вариант возрастной нормы.
Данная работа представляет собой фрагмент комплексного изучения лимфоидной составляющей иммунной системы детей первого года жизни с тимомегалией, посвященный характеристике естественных регуляторных Т-клеток (Тгед), присутствующих в их циркуляции. Исключительная роль, которая принадлежит Тгед в функционировании иммунной системы в норме и при разнообразной патологии, широко освещена в научной иммунологической печати [9,10]. Развитие этих клеток связано по преимуществу с тимусом,
причем их коренное отличие от других субпопуляций Т-лимфоцитов определяется особенностями процесса селекции [11]. В связи с вероятной связью тимомегалии с нарушением процессов селекции тимоцитов естественно было рассмотреть возможность нарушений численности и активности Тгед (в частности, экспрессии их ключевого гена — FOXP3) при тимомегалии у детей первого года жизни, когда процессы развития Т-лимфоцитов, включая Тгед, проявляют максимальную зависимость от тимуса.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследовано 70 детей с тимомегалией в возрасте до 1 года (36 детей до 3 мес), обследованных в связи с различными заболеваниями (ОРВИ, пневмонии, менингоэнцефалит, послеродовая патология, синдром Дауна и т.д). В половине случаев (36 детей) поводом для обращения к врачу послужила ОРВИ; с целью снижения степени гетерогенности обследуемые дети с ОРВИ на фоне тимомегалии были выделены в особую подгруппу. Группа сравнения включала 26 детей (21 ребенок — до 3 мес) с соответствующим спектром заболеваний (13 - c ОРВИ).
Размер тимуса определяли рентгенологически. Степень тимомегалии определялась на основе величины кардио-тимико-торакально-го индекса (КТТИ), который рассчитывали как отношение ширины тимуса к ширине грудной клетки на уровне куполов диафрагмы. Первая степень тимомегалии (КТТИ 0,33-0,36) выявлена у 5 детей, 2 степень (КТТИ 0,37-0,42) - у 38, 3 степень (КТТИ 0,43 и более) - у 19 детей.
Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови обследованных детей центрифугированием (400 g - 30 мин) на слое фиколла-верографина плотностью 1,077 по Boyum. Отмытые клетки из интерфазы ре-суспензировали в среде RPMI 1640 («Sigma»), и культивировали в пластиковых 96-луноч-ных планшетах («Costar») при 37°С в атмосфере с 5% СО2 в СО2-инкубаторе («Jouan»). В качестве полной питательной среды использовали HEPES модифицирорванную среду RPMI 1640 («Sigma») с добавлением 10% сыворотки эмбрионов теленка («Sigma»), L-глута-мина (300 мкг/мл; «Flow Laboratories»). Исходная концентрация клеток в культурах составляла 5 • 105 клеток в 1 мл. Длительность культивирования варьировала от 18 часов до 3 сут.
Мембранный фенотип клеток оценивали методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, меченных флуорохромами. Инкубацию клеток с моноклональными антителами осуществляли в течение 30 мин. при температуре 2 — 8 °С. Затем клетки отмывали, фиксировали 1% параформальдегидом («Sigma»), приготовленным на забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН — 7,2, и анализировали на проточном цитометре. Использовали моноклональные антитела к CD3 и CD4, меченные флуоресцеинизотио-цианатом (ФИТЦ), и антитела к CD4, CD25, HLA-DR, меченные фикоэритрином (ФЭ) (все антитела, кроме анти-CD25 — «Сорбент», Москва; анти-CD25 — «Becton Dickinson»). Проточную цитофлуоримет-рию осуществляли на цитофлуориметре «FACSCalibur» («Becton Dickinson») c использованием программы CellQuest 3.1(«Becton Dickinson», Mountain View, CA). Клетки анализировали в лучах аргонового лазера (15 мВт, 488 нм) при скорости потока 10 000 клеток в 1 с. На основе определения параметров малого углового (FSC) и бокового (SSC) светорассеяния в окне Dot Plot FSC-SSC выделяли облако лимфоцитов — R1. Лимфоциты из области R1 анализировали на наличие флуоресцентных меток в режимах FL-1 и FL-2.
Экспрессию генов изучали методом поли-меразной цепной реакции (ПЦР). В работе использовали коммерческие реактивы фирмы «НПФ ДНК-Технология». Из клеток моно-нуклеарной фракции экстрагировали РНК. Оценивали экспрессии генов FOXP3, IL6, TGFbl, IL10, IL17. В качестве нормировочного гена был использован ген «домашнего хозяйства» hprt1 (гипоксантин-гуанин фосфорибо-зилтрансферазы). Зонды для цитокинов и hprt1 метили Fam(dT). Амплификацию осуществляли в режиме «реального времени» в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл — 80°С 30 сек, 94°С 1 мин; 50 циклов — 94°С 10 сек, 62°С — 20 сек. Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 62°С. Дополнительный контроль прохождения реакции осуществляли методом электрофореза в 2% агарозном геле. В работе использовали реактивы и прибор «ДТ-322» производства фирмы «НПФ ДНК-Технология».
Уровень экспрессии генов цитокинов измеряли в относительных единицах, определяемых методом сравнения индикаторных
циклов Cp (т.е. циклов автоматически определяемых приборным обеспечением на основе математического анализа формы кривой амплификации) цитокина и hprt1, по формуле:
[il]/[hprt1] = 2cp1-cp2 (формула 1), [il]/[hprt11] — уровень экспрессии цитокина,
Ср1 — значение индикаторного цикла в образце для hprt1,
Ср2 — значение индикаторного цикла в образце для исследуемого цитокина.
Уровень экспрессии фактически отражает представленность транскрипта в сравнении с нормировочным геном.
В случае нормального распределения показателей использовали традиционные методы статистической обработки с выражением результатов в виде M ± а и расчетом t-критерия Стьюдента. При отклонениях от нормального распределения использовали непараметрические методы статистического анализа. Результаты представляли в виде Ме (L — H), где Ме — медиана, L — нижний квартиль, Н — верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использован U-критерий Манна-Уитни. Для выявления взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену. Различие групп считали статистически значимым при р < 0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В таблице 1 отражены показатели численности лимфоцитов и Т-клеток, в частности ре-гуляторных, а также уровни экспрессии маркера Тгед — транскрипционного фактора FOXP3 у детей с тимомегалией в сопоставлении с группой сравнения. Параллельно представлены данные для более гомогенных подгрупп — детей с тимомегалией, страдающих ОРВИ, и в качестве группы сравнения — детей с ОРВИ без тимомегалии. В объединенной (без учета сопутствующей патологии) группе детей с тимомегалией зарегистрировано статистически значимое снижение абсолютного и относительного содержания в крови лимфоцитов, Т-клеток, CD4+ Т-клеток и их активированной фракции (CD4+CD25lo). Сниженными оказались также абсолютное содержание Тгед (CD4+CD25hi) и экспрессия их маркерного гена FOXP3 (рис. 1А). В под-
А
□ ГС птм
т
— g о о
1 т
ф< КХ О
— Л > > X
л. X JK :х
БОХРЗ ТОБЬ П.-10 1Ь-6 \L-11 □ ГС □ тм
Рис
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.