ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2010, № 1, с. 105-108
КРАТКИЕ ^^^^^^^^^^^^^^^^ СООБЩЕНИЯ
УДК 577.122
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ И ОКСАЛАТОКСИДАЗЫ КОРНЕЙ ПШЕНИЦЫ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ
© 2010 г. С. А. Аленькина, В. Е. Никитина
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, 410049 Саратов, просп. Энтузиастов, 13
E-mail.~alenkina@ibppm.sgu.ru Поступила в редакцию 10.06.2009 г.
Показано, что лектины, выделенные с поверхности почвенных азотфиксирующих бактерий Azospirillum Ьгаяйете $р7 и его мутанта по лектиновой активности А. Ьгаяйете $р7.2.3 способны стимулировать быстрое образование перекиси водорода, связанное с повышением активности оксала-токсидазы и пероксидазы корней проростков пшеницы. Наиболее быстро индуцируемым путем образования перекиси водорода в корнях проростков пшеницы под действием лектинов является окисление щавелевой кислоты оксалатоксидазой (достаточно 10-минутной обработки корней лек-тинами в концентрации 10 мкг/мл). Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азо-спирилл способны выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы.
Информации о функционировании ассоциативных симбиозов пока еще недостаточно для глубокого понимания этого явления, и многие вопросы остаются пока неясными. Одним из невыясненных является вопрос о том, какие молекулярные сигналы (растения к бактерии и наоборот) лежат в основе установления и эффективного функционирования ассоциативного симбиоза.
Показано, что многие биотические и абиотические воздействия могут вызывать резкое увеличение образования растительными клетками перекиси водорода и других активных форм кислорода. Синтез перекиси водорода — один из наиболее быстрых ответов растительной клетки на индуцирующие воздействия. Пути образования активных форм кислорода в растениях многообразны и активно обсуждаются в научной литературе. Считается, что основным источником перекиси водорода в клетках растений является дисмутация молекулы кислорода, катализируемая супероксиддисмутазой (Chen, Schopfer, 1999; Дьяков и др., 2001). Однако в последнее время большой интерес вызывают альтернативные пути образования перекиси водорода. Пероксидазы классически рассматриваются в качестве антиоксидантов, защищающих клетки от разрушительного действия перекиси водорода. Однако, помимо такой активности, пероксидазы могут проявлять и оксидазную активность с окислением железа гема из валентности 2 в валентность 3 и передачей электронов от никотинамидадениндинуклео-тидфосфата и никотинамидадениндинуклеотида на кислород (Frahry, Schopfer, 1998). Перекись водорода может образовываться также при окислении щавелевой кислоты и ее солей — оксалатов оксалаток-сидазой. Среди индукторов, способных вызывать быструю продукцию Н2О2 в клетках растений, наи-
более хорошо исследована активность гликопроте-инов, входящих в состав клеточных стенок многих фитопатогенньк организмов (Lyon et al., 1995; Kauss, Jeblik, 1996). Бествик с соавт. (Bestwick et al., 1997) продемонстрировал секрецию пероксидазы и Н2О2 в местах инфицирования патогеном листьев табака. Обнаружено, что защитные реакции растений с участием пероксидазы и Н2О2 могут индуцироваться такими компонентами клеточной стенки фитопатогенных грибов, как хитин, хитозан и хи-тоолигосахариды, которые известны своей элиси-торной активностью (Pearce, Ride, 1982). Вовлечение оксалатоксидазы в каскад защитных реакций показано при поражении грибными патогенами разных видов растений (Dumas et al., 1995; Donaldson et al., 2001; Яруллина и др., 2003).
Для корней проростков пшеницы одним из биогенных факторов являются находящиеся в прикорневой зоне азотфиксирующие ассоциативные бактерии рода Azospirillum, стимулирующие рост и развитие растений. Было показано, что инициация взаимодействия бактерий с корнями происходит по принципу лиганд-рецепторного взаимодействия. Установлено, что со стороны азоспирилл в этом процессе, в числе других факторов, участвуют лек-тины, находящиеся на поверхности клетки (Никитина и др., 1996).
Целью исследования была оценка способности лектинов азоспирилл индуцировать активность пе-роксидазы и оксалатоксидазы в корнях проростков пшениц^!.
106
АЛЕНЬКИНА, НИКИТИНА
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В работе были использованы лектины двух штаммов — A. brasilense Sp7, полученного из Института микробиологии РАН (Москва) и его мутанта, дефектного по лектиновой активности — A. brasilense Sp7.2.3 (Аленькина и др., 1998).
Для обнаружения лектинов использовали реакцию гемагглютинации, проводимую с трипсинизи-рованными эритроцитами кролика (Lis, Sharon, 1972).
В экспериментах использовали кристаллические препараты лектинов, полученные после двукратного осаждения сульфатом аммония и спирто-ацетоновой смесью. Белок определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).
Культуры азоспирилл выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции при 37°С в течение 18 ч (Sadasivan, Neyra, 1985).
Выделение лектинов с поверхности клеток проводили методом Эшдата и Шарона (Echdat et al, 1978).
В работе использовали 3-суточные проростки пшеницы Саратовская 29. Семена стерилизовали 1 мин 60%-ным этанолом и проращивали на дистиллированной воде при 22°С. Перед опытами у проростков удаляли эндосперм и промывали корни дистиллированной водой. После этого по 10 проростков переносили в чашки Петри на раствор 0.01 М KCl (10 мл) и выдерживали не менее 4 ч для снятия раневого стресса. Для оценки способности лектинов индуцировать активность ферментов проростки 10 мин инкубировали в 0.01 М KCl, содержащем препараты лектинов (концентрация 10, 20 и 40 мкг/мл). В контроле проростки находились 10 мин в растворе 0.01 М KCl. Затем среду заменяли на свежую, содержащую 0.05%-ный о-фенилен-диамин (ОФД). Сразу же после этого реакцию инициировали добавлением 1 мл 0.025 М щавелевой кислоты или перекиси водорода в конечной концентрации 0.01 мМ, перемешивали среду осторожными круговыми движениями в чашке Петри и с интервалом 2 мин отбирали по 0.2 мл среды. Аликвоты вносили в лунки плоскодонного планшета для иммуноанализа ("Медполимер", С.-Петербург), куда предварительно добавляли 0.05 мл 4 М H2SO4. Поглощение образцов (при 492 нм) измеряли на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-О1С (ЗАО ИЛИП, Россия). Активность окисления ОФД выражали в единицах поглощения на 1 г сырой массы корня (Хайруллин и др., 2001).
Результаты представлены как средние значения трех повторностей ± стандартное отклонение (Ро-кицкий, 1973).
В работе были исследованы лектины двух штаммов азоспирилл — А. ЬгазИвтв 8р7 и мутант этого штамма А. ЬгазИвтв 8р7.2.3. Лектин А. ЬгазИвтв 8р7 — гликопротеин, выделенный с поверхности клеток с молекулярной массой 36 кДа и специфичностью к Ь-фукозе (1.87 мМ) и к Э-галактозе (20 мМ) (Итальянская и др., 1989). Лектин мутант-ного штамма с той же молекулярной массой и углеводной специфичностью, что и родительский, но с измененными антигенными свойствами. Лек-тины имели не только структурные различия, но обладали различной функциональной активностью (Аленькина и др., 1998; А1еп'кпа а1., 2006; Никитина и др., 2001; Аленькина и др., 2007). Было показано, что лектины азоспирилл способны осуществлять наряду с другими факторами адгезию бактерий к корням растений, стимулировать прорастание семян, проявлять по отношению к растительной клетке митотическую и ферментмодифицирующую активность (Никитина и др., 2004; Чернышева и др., 2005; А1еп'кпа а1., 2006). Все эти факты свидетельствуют о возможной роли лектинов азоспирилл в адаптационных механизмах растений.
Среди факторов внешней среды, воздействующих на организм, особое внимание принадлежит группе факторов, приводящих к так называемому окислительному взрыву. Накопленные к настоящему времени экспериментальные данные дают основание полагать, что значительную роль в образовании перекиси водорода в ходе окислительного взрыва в растительной клетке играют пероксидазы и оксалатоксидазы, локализованные на внешней поверхности растительных клеток (Тарчевский, 2002).
Из литературы известно, что по мере роста корня активность этих ферментов может меняться и наибольшая активность наблюдается в корнях 2-3-су-точных проростков (Хайруллин и др., 2001). В связи с этим для наших исследований были взяты корни 3-суточных проростков пшеницы.
Оценивали три концентрации лектинов — 10, 20 и 40 мкг/мл. Об активности ферментов судили по интенсивности окисления ОФД. Для оценки способности лектинов оказывать влияние на перокси-дазу в среду вносили перекись водорода в конечной концентрации 0.01 мМ. Добавление в среду Н2О2 способствовало увеличению окисления ОФД для всех концентраций лектинов обоих штаммов по сравнению с контрольным вариантом, но только в том случае, когда время выдерживания корней с лектинами составляло 20 мин (изучались временные интервалы 10 и 20 мин). Самой эффективной концентрацией для обоих лектинов явилась концентрация 40 мкг/мл.
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ И ОКСАЛАТОКСИДАЗЫ
107
Как видно из табл. 1, лектин родительского штамма вызывает увеличение пероксидазной активности в большей степени, чем лектин мутантно-го штамма.
Как уже было отмечено, одним из альтернативных путей образования перекиси водорода в растениях может быть также окисление щавелевой кислоты оксалатоксидазой, локализованной на поверхности корней (Нигкшап, Тапака, 1996). Оказалось, что 10-минутная обработка корней проростков растений препаратами лектинов вызывала активацию оксалатоксидазы. Лектины родительского и мутантного штаммов проявляли различия. Если лектин родительского штамма при указанной экспозиции вызывал эффект при концентрации 10мкг/мл, лектин же мутантного штамма — при 20 мкг/мл. Так, активность для родительского и мутантного штаммов составила через 8 мин после инициации реакции 11.2 ± 1.3 и 7.2 ± 0.5 ед. на 1 г сырой массы соответственно, в контрольных проростках, т.е. не инкубированных с лектинами, она была 6.0 ± 0.2 ед. на 1 г сырой массы (табл. 2).
Таким образом, лектины азоспирилл способны регулировать в растениях уровень перекиси водорода благодаря
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.