научная статья по теме РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА ARABIDOPSIS THALIANA L. СИНИМ СВЕТОМ Биология

Текст научной статьи на тему «РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА ARABIDOPSIS THALIANA L. СИНИМ СВЕТОМ»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 4, с. 287-292

УДК 577.218

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА Arabidopsis ФаГтпа Ъ. СИНИМ СВЕТОМ

© 2015 г. А. Т. Епринцев*, Н. В. Селиванова, Д. Н. Федорин

Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1;

*электронная почта: bc366@bio.vsu.ru Поступила в редакцию 28.01.2015 г.

Изучено влияние светового режима на активность сукцинатдегидрогеназы в растениях Arabidopsis {НаИапа. После кратковременного облучения растений арабидопсиса дикого типа синим светом в течение 15 мин и последующего выдерживания в темноте активность сукцинатдегидрогеназы снижалась, тогда как в растениях с нокаутом гена криптохрома 1 (сгу-1) этот эффект не наблюдался. Воздействие синего света на растения арабидопсиса с нокаутом гена сгу-1 не влияло на активность сукцинатдегидрогеназы на протяжении всего времени экспозиции. Показано, что активная форма криптохрома 1 участвует в регуляции экспрессии гена sdh1-2, вызывая уменьшение скорости синтеза мРНК. Полученные данные свидетельствуют об участии системы криптохрома в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы на уровне транскрипции гена sdh1-2.

Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, криптохром, регуляция, транскрипция, синий свет.

Б01: 10.7868/80233475515040040

ВВЕДЕНИЕ

Свет служит главным источником энергии, обеспечивающим протекание всех метаболических процессов в растениях. Однако в отсутствие света в темное время суток энергетические потребности клеток растений решаются благодаря функционированию темнового дыхания путем активации многих ферментативных систем, обеспечивающих протекание энергетического метаболизма [1]. Реакция цикла Кребса, катализируемая сукци-натдегидрогеназой (СДГ, [КФ 1.3.99.1]), встроенной во внутреннюю мембрану митохондрий, может быть точкой сопряжения энергетических и биосинтетических процессов в клетке [2]. Активность СДГ может коррелировать со световым режимом и регулировать работу всего цикла. Активность СДГ модулируется светом на уровне транскрипции, при этом первичный сигнал улавливается фито-хромной системой, которая передает сигнал через ряд посредников [3, 4]. Известно, что в растениях Arabidopsis ЛаНапа скорость экспрессии генов субъединицы В СДГ контролируется фитохромом [5, 6]. Ввиду этого особый научный интерес представляет изучение молекулярных механизмов переключения энергетического метаболизма клетки при изменении светового режима.

Растения содержат набор фоторецепторов, воспринимающих свет в разных частях видимой области, наиболее важным из которых является криптохромная система [7].

Криптохромы широко распространены в растениях, где они контролируют важные процессы развития на протяжении всей их жизни [7, 8]. Высшие растения, как правило, обладают двумя криптохромами с функциональной диверсификацией. Криптохромы представляют собой класс фоторецепторов, контролирующих важные процессы в растениях, прежде всего путем регуляции экспрессии генов [9]. Однако механизм крипто-хромзависимой регуляции экспрессии генов остается во многом неясным, поэтому молекулярные механизмы передачи криптохромного сигнала вызывают интерес. В ряде работ показано, что действие фотоактивных криптохромов опосредуется регуляторными компонентами, такими как ЕЗ-убиквитинлигазный комплекс, различные факторы транскрипции [8, 10, 11].

Механизм передачи криптохромного сигнала мало изучен. Показано, что при освещении растений синим светом изменяются уровни Са2+ в ци-тозоле, известна также способность криптохро-мов стимулировать анионные каналы [12, 13].

Цель данной работы состояла в изучении регуляции синим светом активности СДГ в зеленых листьях арабидопсиса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объектов исследования использовали 24-дневные проростки А. ЛаНапа Ь., выра-

287

5*

288

ЕПРИНЦЕВ и др.

Рис. 1. Активность сукцинатдегидрогеназы в листьях арабидопсиса дикого типа в условиях разного светового режима. Свет — растения, освещенные белым светом; темнота — растения, выдержанные в течение 24 ч в темноте; 1—24 ч — время экспозиции растений после облучения в течение 15 мин синим светом.

щенные при 12-часовом световом дне с интенсивностью света 25 Вт/м2. Использовали семена двух линий A. thaliana: растений дикого типа (Col-0) и мутантных по гену cry-1, полученные из Института Макса Планка (Гольм, Германия).

Белый свет получали от ламп дневного света в установке "Флора-1". Синий свет (СС) давали светодиоды с областью испускания 465—470 нм (ОАО "Протон", Россия). Интенсивность света 0.044 Вт/м2, была достаточной для возникновения сигнальных реакций, связанных с участием криптохромной системы, но не вызывала интенсификации процесса фотосинтеза.

Для создания различного светового режима растения помещали в темную камеру на 24 ч (вариант "темнота"). Криптохромную систему активировали облучением растений синим светом (вариант "СС") в течение 15 мин после 24-часовой инкубации в темноте.

Фракцию ядер из растительного материала выделяли согласно методике, предложенной Lee и Lin [14].

Содержание свободного кальция в ядрах измеряли спектрофотометрически по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина [15].

Степень загрязнения ядер определяли при помощи цитоплазматических маркерных ферментов — алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.

Активность лактатдегидрогеназы определяли при помощи оптического теста Варбурга [16], используя 1 мМ пируват натрия в качестве субстрата.

Активность алкогольдегидрогеназы измеряли спектрофотометрически по скорости восстановления NAD+ при 340 нм в присутствии 150 мМ этанола [17].

Активность СДГ определяли при помощи метода, основанного на использовании искусственных акцепторов электронов с соответствующим редокс-потенциалом [18].

За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 25°С.

Общее количество белка определяли по методу Лоури [19].

Суммарную клеточную РНК выделяли с использованием набора Magna RNA Prep 100 ("Ам-плисенс", Россия) согласно рекомендациям производителя.

Обратную транскрипцию мРНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MuLV ("СибЭнзим", Россия) согласно инструкции производителя.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I и праймеры к гену sdh1-2: прямой — 5 '-CAAACGGGTCACTTCCAACT-3', и обратный -5 '- CCAAAACTGTCCCACGTCTT- 3 '. Амплификацию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация — 95°С, 5 мин; цикл — 95°С, 30 с; 60°С, 30 с; 72°С, 30 с (детекция); заключительная элонгация — 72°С, 10 мин. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции.

Полученные данные обрабатывали с использованием критерия Стьюдента. Обсуждаются статистически значимые различия прир < 0.05 [20].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для выяснения участия криптохромной системы в регуляции активности СДГ растения арабидопсиса экспонировали на синем свету (465 нм) в течение 15 мин. В качестве контроля использовали растения, выдержанные в течение 24 ч в темноте, для активации СДГ и снятия всех светозави-симых эффектов. Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что активность СДГ в контрольных растениях (темнота) в 5.3 раза выше, чем на свету. Это обусловлено ингибированием цикла Кребса при освещении зеленых листьев растений, когда основным источником энергетических эквивалентов является фотосинтез [2].

Через 1 ч после импульсного облучения синим светом опытных растений наблюдалось незначительное снижение активности — в 1.16 раза по сравнению с темновым вариантом. При этом активность в листьях арабидопсиса составила 0.053 Е/г сырой массы. В последующие 2 ч активность СДГ изменялась от 0.059 до 0.052 Е/г сырой массы, т.е. на 1—8% по сравнению с темновым вариантом. Значительное снижение активности СДГ наблю-

РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА 289

далось на 3 ч экспозиции, когда активность фермента снижалась в 2.8 раза. На четвертый час экспозиции обнаружили уменьшение активности фермента в 2.5 раза, что соответствовало изменениям в пределах от 0.024 до 0.027 Е/г сырой массы, и в дальнейшем исследуемый показатель оставался на данном уровне.

Длительная экспозиция растений в темноте (24 ч) после импульсного облучения листьев ара-бидопсиса синим светом приводила к увеличению активности СДГ до 0.056 Е/г сырой массы, что составляло 93.3% от значений в контрольном варианте. По нашему мнению, обнаруженная активация СДГ обусловлена снятием ингибирую-щего действия криптохрома после его перехода в неактивную форму [21]. Инактивация крипто-хрома также может быть обусловлена повторным окислением FAD в темноте активными формами кислорода, что приводит к восстановлению молекулы рецептора и переводу ее в неактивную кон-формацию [22].

Постоянное облучение растений арабидопси-са с нокаутом гена cry-1 не приводило к снижению активности СДГ (рис. 2). При постоянном облучении растений синим светом активность СДГ находилась в пределах от 0.055 до 0.063 Е/г сырой массы.

Дыхание растений — светозависимый процесс, важная роль в регуляции которого принадлежит фитохромам. Ранее было установлено, что действие гетерогенного белого света на гомогенный препарат СДГ из листьев кукурузы не влияет существенно на активность фермента [23]. Полученные данные позволяют предположить, что в регуляции СДГ при облучении растений синим светом принимает участие криптохромная система. Действие криптохрома может проявляться в регуляции экспрессии соответствующих генов.

Показано, что относительная концентрация мРНК СДГ в растениях арабидопсиса дикого типа на свету значительно меньше, чем в растениях, находящихся в темноте. После облучения в течение 15 мин с последующей 3-часовой экспозицией в темноте наблюдали высокий уровень экспрессии гена sdh1-2. Однако после 4 ч пребывания в темноте экспрессия гена sdh1-2 значительно снижалась. При этом относительный уровень экспрессии (2.24) был в 1.7 раза мен

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком