БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2015, том 32, № 4, с. 287-292
УДК 577.218
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА Arabidopsis ФаГтпа Ъ. СИНИМ СВЕТОМ
© 2015 г. А. Т. Епринцев*, Н. В. Селиванова, Д. Н. Федорин
Воронежский государственный университет, 394006, Воронеж, Университетская пл., 1;
*электронная почта: bc366@bio.vsu.ru Поступила в редакцию 28.01.2015 г.
Изучено влияние светового режима на активность сукцинатдегидрогеназы в растениях Arabidopsis {НаИапа. После кратковременного облучения растений арабидопсиса дикого типа синим светом в течение 15 мин и последующего выдерживания в темноте активность сукцинатдегидрогеназы снижалась, тогда как в растениях с нокаутом гена криптохрома 1 (сгу-1) этот эффект не наблюдался. Воздействие синего света на растения арабидопсиса с нокаутом гена сгу-1 не влияло на активность сукцинатдегидрогеназы на протяжении всего времени экспозиции. Показано, что активная форма криптохрома 1 участвует в регуляции экспрессии гена sdh1-2, вызывая уменьшение скорости синтеза мРНК. Полученные данные свидетельствуют об участии системы криптохрома в регуляции активности сукцинатдегидрогеназы на уровне транскрипции гена sdh1-2.
Ключевые слова: сукцинатдегидрогеназа, криптохром, регуляция, транскрипция, синий свет.
Б01: 10.7868/80233475515040040
ВВЕДЕНИЕ
Свет служит главным источником энергии, обеспечивающим протекание всех метаболических процессов в растениях. Однако в отсутствие света в темное время суток энергетические потребности клеток растений решаются благодаря функционированию темнового дыхания путем активации многих ферментативных систем, обеспечивающих протекание энергетического метаболизма [1]. Реакция цикла Кребса, катализируемая сукци-натдегидрогеназой (СДГ, [КФ 1.3.99.1]), встроенной во внутреннюю мембрану митохондрий, может быть точкой сопряжения энергетических и биосинтетических процессов в клетке [2]. Активность СДГ может коррелировать со световым режимом и регулировать работу всего цикла. Активность СДГ модулируется светом на уровне транскрипции, при этом первичный сигнал улавливается фито-хромной системой, которая передает сигнал через ряд посредников [3, 4]. Известно, что в растениях Arabidopsis ЛаНапа скорость экспрессии генов субъединицы В СДГ контролируется фитохромом [5, 6]. Ввиду этого особый научный интерес представляет изучение молекулярных механизмов переключения энергетического метаболизма клетки при изменении светового режима.
Растения содержат набор фоторецепторов, воспринимающих свет в разных частях видимой области, наиболее важным из которых является криптохромная система [7].
Криптохромы широко распространены в растениях, где они контролируют важные процессы развития на протяжении всей их жизни [7, 8]. Высшие растения, как правило, обладают двумя криптохромами с функциональной диверсификацией. Криптохромы представляют собой класс фоторецепторов, контролирующих важные процессы в растениях, прежде всего путем регуляции экспрессии генов [9]. Однако механизм крипто-хромзависимой регуляции экспрессии генов остается во многом неясным, поэтому молекулярные механизмы передачи криптохромного сигнала вызывают интерес. В ряде работ показано, что действие фотоактивных криптохромов опосредуется регуляторными компонентами, такими как ЕЗ-убиквитинлигазный комплекс, различные факторы транскрипции [8, 10, 11].
Механизм передачи криптохромного сигнала мало изучен. Показано, что при освещении растений синим светом изменяются уровни Са2+ в ци-тозоле, известна также способность криптохро-мов стимулировать анионные каналы [12, 13].
Цель данной работы состояла в изучении регуляции синим светом активности СДГ в зеленых листьях арабидопсиса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве объектов исследования использовали 24-дневные проростки А. ЛаНапа Ь., выра-
287
5*
288
ЕПРИНЦЕВ и др.
Рис. 1. Активность сукцинатдегидрогеназы в листьях арабидопсиса дикого типа в условиях разного светового режима. Свет — растения, освещенные белым светом; темнота — растения, выдержанные в течение 24 ч в темноте; 1—24 ч — время экспозиции растений после облучения в течение 15 мин синим светом.
щенные при 12-часовом световом дне с интенсивностью света 25 Вт/м2. Использовали семена двух линий A. thaliana: растений дикого типа (Col-0) и мутантных по гену cry-1, полученные из Института Макса Планка (Гольм, Германия).
Белый свет получали от ламп дневного света в установке "Флора-1". Синий свет (СС) давали светодиоды с областью испускания 465—470 нм (ОАО "Протон", Россия). Интенсивность света 0.044 Вт/м2, была достаточной для возникновения сигнальных реакций, связанных с участием криптохромной системы, но не вызывала интенсификации процесса фотосинтеза.
Для создания различного светового режима растения помещали в темную камеру на 24 ч (вариант "темнота"). Криптохромную систему активировали облучением растений синим светом (вариант "СС") в течение 15 мин после 24-часовой инкубации в темноте.
Фракцию ядер из растительного материала выделяли согласно методике, предложенной Lee и Lin [14].
Содержание свободного кальция в ядрах измеряли спектрофотометрически по цветной реакции с мурексидом в присутствии глицерина [15].
Степень загрязнения ядер определяли при помощи цитоплазматических маркерных ферментов — алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы.
Активность лактатдегидрогеназы определяли при помощи оптического теста Варбурга [16], используя 1 мМ пируват натрия в качестве субстрата.
Активность алкогольдегидрогеназы измеряли спектрофотометрически по скорости восстановления NAD+ при 340 нм в присутствии 150 мМ этанола [17].
Активность СДГ определяли при помощи метода, основанного на использовании искусственных акцепторов электронов с соответствующим редокс-потенциалом [18].
За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата за 1 мин при 25°С.
Общее количество белка определяли по методу Лоури [19].
Суммарную клеточную РНК выделяли с использованием набора Magna RNA Prep 100 ("Ам-плисенс", Россия) согласно рекомендациям производителя.
Обратную транскрипцию мРНК проводили с использованием обратной транскриптазы M-MuLV ("СибЭнзим", Россия) согласно инструкции производителя.
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени проводили на приборе Bio-Rad DNA Engine Thermal Cycler Chromo 4 (Bio-Rad, США), используя в качестве красителя SYBR Green I и праймеры к гену sdh1-2: прямой — 5 '-CAAACGGGTCACTTCCAACT-3', и обратный -5 '- CCAAAACTGTCCCACGTCTT- 3 '. Амплификацию проводили в следующем режиме: предварительная денатурация — 95°С, 5 мин; цикл — 95°С, 30 с; 60°С, 30 с; 72°С, 30 с (детекция); заключительная элонгация — 72°С, 10 мин. В качестве отрицательного контроля использовали суммарную РНК без этапа обратной транскрипции.
Полученные данные обрабатывали с использованием критерия Стьюдента. Обсуждаются статистически значимые различия прир < 0.05 [20].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Для выяснения участия криптохромной системы в регуляции активности СДГ растения арабидопсиса экспонировали на синем свету (465 нм) в течение 15 мин. В качестве контроля использовали растения, выдержанные в течение 24 ч в темноте, для активации СДГ и снятия всех светозави-симых эффектов. Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что активность СДГ в контрольных растениях (темнота) в 5.3 раза выше, чем на свету. Это обусловлено ингибированием цикла Кребса при освещении зеленых листьев растений, когда основным источником энергетических эквивалентов является фотосинтез [2].
Через 1 ч после импульсного облучения синим светом опытных растений наблюдалось незначительное снижение активности — в 1.16 раза по сравнению с темновым вариантом. При этом активность в листьях арабидопсиса составила 0.053 Е/г сырой массы. В последующие 2 ч активность СДГ изменялась от 0.059 до 0.052 Е/г сырой массы, т.е. на 1—8% по сравнению с темновым вариантом. Значительное снижение активности СДГ наблю-
РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗНОГО КОМПЛЕКСА 289
далось на 3 ч экспозиции, когда активность фермента снижалась в 2.8 раза. На четвертый час экспозиции обнаружили уменьшение активности фермента в 2.5 раза, что соответствовало изменениям в пределах от 0.024 до 0.027 Е/г сырой массы, и в дальнейшем исследуемый показатель оставался на данном уровне.
Длительная экспозиция растений в темноте (24 ч) после импульсного облучения листьев ара-бидопсиса синим светом приводила к увеличению активности СДГ до 0.056 Е/г сырой массы, что составляло 93.3% от значений в контрольном варианте. По нашему мнению, обнаруженная активация СДГ обусловлена снятием ингибирую-щего действия криптохрома после его перехода в неактивную форму [21]. Инактивация крипто-хрома также может быть обусловлена повторным окислением FAD в темноте активными формами кислорода, что приводит к восстановлению молекулы рецептора и переводу ее в неактивную кон-формацию [22].
Постоянное облучение растений арабидопси-са с нокаутом гена cry-1 не приводило к снижению активности СДГ (рис. 2). При постоянном облучении растений синим светом активность СДГ находилась в пределах от 0.055 до 0.063 Е/г сырой массы.
Дыхание растений — светозависимый процесс, важная роль в регуляции которого принадлежит фитохромам. Ранее было установлено, что действие гетерогенного белого света на гомогенный препарат СДГ из листьев кукурузы не влияет существенно на активность фермента [23]. Полученные данные позволяют предположить, что в регуляции СДГ при облучении растений синим светом принимает участие криптохромная система. Действие криптохрома может проявляться в регуляции экспрессии соответствующих генов.
Показано, что относительная концентрация мРНК СДГ в растениях арабидопсиса дикого типа на свету значительно меньше, чем в растениях, находящихся в темноте. После облучения в течение 15 мин с последующей 3-часовой экспозицией в темноте наблюдали высокий уровень экспрессии гена sdh1-2. Однако после 4 ч пребывания в темноте экспрессия гена sdh1-2 значительно снижалась. При этом относительный уровень экспрессии (2.24) был в 1.7 раза мен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.