МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 3, с. 335-342
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.852.11.042
РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS В РЕКОМБИНАНТНОМ ШТАММЕ BACILLUS SUBTILIS НА СТАДИИ СПОРООБРАЗОВАНИЯ
© 2004 г. И. Б. Частухина*, М. Р. Шарипова*1, Л. А. Габдрахманова*, Н. П. Балабан*, Д. Р. Сафина***, С. В. Костров***, Г. Н. Руденская**, И. Б. Лещинская*
*Казанский государственный университет **Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова ***Институт молекулярной генетики РАН, Москва Поступила в редакцию 04.03.03 г.
Исследованы условия роста рекомбинантного штамма Bacillus subtilis AJ73, несущего ген глутами-лэндопептидазы B. intermedius 3-19 на мультикопийной плазмиде, и влияние ряда факторов среды на эффективность продукции фермента в стационарной фазе роста бактерий. В этот период накопление фермента в культуральной жидкости имеет два максимума на 48 и 78 ч роста, а уровень активности зависит от состава компонентов питательной среды. Биосинтез глутамилэндопептидазы не подавляется глюкозой, в отличие от фермента, секретируемого в трофофазу во время пролиферации. В многофакторных экспериментах установлено оптимальное соотношение концентраций основных компонентов питательной среды (пептона и неорганического фосфата) для накопления фермента. Неорганический фосфат и ионы аммония оказывают стимулирующее действие на накопление протеиназы (до 130-250%). Сложные органические субстраты - казеин и желатин - активируют синтез фермента (до 150-200%). Показано, что на заключительных стадиях развития культуры ионы Ca2+, Mg2+ и Co2+ повышают, а Zn2+, Fe2+ и Cu2+ угнетают продуктивность культуры в отношении синтеза глутамилэндопептидазы. Сделано заключение, что механизмы регуляции синтеза этой протеиназы во время вегетативного роста или спорообразования различаются.
Ключевые слова: глутамилэндопептидаза, регуляция биосинтеза, рекомбинантный штамм, условия роста, спорообразование.
Глутамилэндопептидазы (К.Ф. 3.4.21.19) представляют подсемейство сериновых протеиназ, относящееся к семейству химотрипсина. Эти ферменты обладают узкой субстратной специфичностью и расщепляют связи, образованные а-карбоксильны-ми группами глутаминовой и аспарагиновой кислот [1]. Среди микробных глутамилэндопептидаз подробно изучен фермент, секретируемый бактериями B. intermedius в период вегетативного роста [2]. Описаны механизмы регуляции биосинтеза глутамилэндопептидазы B. intermedius, полный ген фермента клонирован в клетках B. subtilis и исследованы условия накопления глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости рекомби-нантных клеток в фазе замедления роста бактерий [3-5]. Глутамилэндопептидаза появляется в культуральной жидкости B. subtilis в стадии замедления роста культуры. Накопление фермента в этот период полностью подавляется глюкозой и активируется в присутствии неорганического фосфата, казеина и желатина. Установлено также, что
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: Margarita.Sharipo-va@ksu.ru).
бактерии B. intermedius секретируют глутамилэндо-пептидазу в период позднего стационара, по времени соответствующего V и VI стадиям спорообразования [6]. Имеются данные, подтверждающие предположение о том, что существует общий контроль регуляции процесса спорообразования и синтеза щелочных протеиназ [7]. Показано, что активное накопление глутамилэндопептидазы в культуральной жидкости B. intermedius 3-19 и инициация процесса спорообразования подвержены катаболитной репрессии глюкозой [6].
Целью настоящей работы является выяснение закономерностей биосинтеза глутамилэндопептидазы B. intermedius 3-19 рекомбинантным штаммом B. subtilis на поздних стадиях развития бактериальной культуры.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве реципиента плазмидной ДНК в работе использовали штамм Bacillus subtilis AJ73, из хромосомы которого делетированы гены внекле-
ч
Рис. 1. Динамика роста культуры и биосинтеза глута-милэндопептидазы рекомбинантным штаммом B. subtilis AJ73: 1 - OD590, опт. ед.; 2 - A, активность глутамилэндопептидазы, ед/мл.
точных протеиназ, любезно предоставленный проф. Ю. Иомантасом, ГНИИ Генетика. Трансформацию клеток B. subtilis плазмидной ДНК проводили по Гловеру [8]. В работе была исследована мультикопийная плазмида pV, сконструированная на основе вектора pCB22 и несущая полный ген глутамилэндопептидазы B. intermedius [3].
Культивирование клеток B. subtilis проводили в колбах объемом 100 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1 : 5 на качалке с 200 об/мин при 30°C. При культивировании клеток B. subtilis в качестве контрольной использовали среду, описанную ранее для штамма B. subtilis AJ73 pV [9], следующего состава (%): пептон - 1.7, дрожжевой экстракт - 0.5, желатин - 1, CaCl2 ■ 2H2O - 0.01, MgSO4 ■ 7H2O - 0.05, NaCl - 0.3, MnSO4 - 0.01, NH4Cl - 0.01, Na2HPO4 - 0.036, pH 8.5. В среду добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл, так как плазмида pV несет ген устойчивости к данному антибиотику. Посевным материалом служила 18-часовая культура (1% объем/объем).
Среду стерилизовали при 1 атм. Раствор неорганического фосфата (Na2HPO4), растворы NH4Cl и C6H6O7(NH4)2, а также соли металлов стерилизовали отдельно при 1 атм и вносили в среду перед посевом. Растворы казеина и желатина стерилизовали отдельно при 0.5 атм и вносили в среду перед посевом. В работе использовали пептон производства Тбилисского завода, дрожжевой экстракт "Difco", желатин фирмы "Sigma", казеин по Гаммерстену фирмы "Serva".
Прирост биомассы измеряли нефелометриче-ски при 590 нм.
Определенне протеолнтнческой активности проводили по методу, описанному ранее [2]. Субстратом служил ияря-нитроанилид карбобензок-си-£-глутаминовой кислоты (2-в1и-рКА). За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкмоль субстрата за 1 мин. Полученный результат умножали на коэффициент 1000.
Продуктивность культуры в отношении синтеза глутамилэндопептидазы (удельная активность) определяли как отношение величины протеолитической активности в культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах.
Споры в культуре обнаруживали микроскопи-рованием после окрашивания по Граму и по Пешкову [10]. О количестве жизнеспособных клеток и спор судили при высеве на чашки бактериальных суспензий путем подсчета числа колоний.
При анализе результатов экспериментов использовали общепринятые методы статистической обработки [11]. Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью программы БТАТОКАРШСБ для персональных компьютеров, позволяющей выводить на экран уравнения регрессии, выводы о степени достоверности модели, графическое изображение поверхности отклика.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследованы динамика роста штамма В. зыЪй-/«, экспрессирующего ген глутамилэндопептидазы В. Шегтекы с плазмиды рУ, и динамика накопления фермента в культуральной жидкости рекомбинантных клеток. Результаты приведены на рис. 1.
Кроме отмеченного ранее максимума глута-милэндопептидазной активности в фазе замедления роста (18-й ч) [9], обнаружены два пика протеолитической активности на поздних стадиях развития культуры В. зыЫШз. Первый соответствовал 48 ч роста и в 2 раза превышал уровень накопления фермента в фазе замедления роста (18-й ч роста). Второй пик соответствовал 78 ч роста и в среднем в 3 раза превышал уровень активности фермента в фазе замедления роста. Мы условно обозначили глутамилэндопептидазу, накопление которой в культуральной жидкости ре-комбинантного штамма происходит в фазе замедления роста, "ранним", а в поздней стационарной фазе - "поздним" ферментом.
При исследовании динамики спорообразования у рекомбинантных клеток В. зыЫШз было установлено, что во время максимального накопления глутамилэндопептидазы на 48 ч культивирования количество спорулирующих клеток и спор достигает 25% от общего количества клеток в культуре, на 78 ч роста эта величина составляет 50%. В дальнейшем количество спор в культуре
Таблица 1. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза глутамилэндопептидазы рекомбинантным штаммом В. яиЬиНя на 48-й ч культивирования
Уровни факторов Биомасса, опт. ед. Активность, ед/мл Продуктивность
Пептон Неорганический фосфат
г/л г/л
0 20 - 0.1 20.4 39.7 1.9
+ 30 + 0.3 20.8 29.0 1.4
- 10 0 0.2 16.3 47.4 2.9
+ 30 0 0.2 18.7 23.1 1.2
0 20 + 0.3 10.0 15.9 1.6
+ 30 - 0.1 14.3 16.6 1.1
- 10 + 0.3 11.6 17.2 1.5
0 20 0 0.2 19.6 47.4 2.4
- 10 - 0.1 15.5 31.4 2.0
остается неизменным и не превышает 50% (±3%). Нас интересовал вопрос о возможной сопряженности синтеза глутамилэндопептидазы и процессов спорообразования.
При переходе от вегетативного состояния к споруляции клетки В. зиЫШз проходят определенную стадию, после которой изменяется реакция клеток на содержание экзогенной глюкозы. Наличие глюкозы в среде до этой стадии приводит к полному или частичному подавлению споруляции по механизму катаболитной репрессии, внесение глюкозы после инициации спорообразования не оказывает влияния на дальнейшее осуществление процесса цитодифференцировки [12]. Согласно этой модели, мы исследовали влияние внесения глюкозы в разные часы роста культуры на продукцию "поздней" глутамилэндопептидазы рекомбинантным штаммом В. зиЫШз на заключительных этапах развития культуры. Глюкозу вносили в среду в концентрации 1% до фазы замедления роста (вместе с инокулятом, на 6-й ч роста и на 10-й ч) и после (20-й, 32-й, 44-й, 56-й, 70-й ч). Установлено, что добавление глюкозы в трофофазе развития культуры (0, 6-й и 10-й ч роста) приводит к резкому снижению ее продуктивности в отношении синтеза "позднего" фермента. Внесение глюкозы в среду, начиная с 20-го ч роста (после инициации спорообразования), не вызывало снижения уровня удельной активности глутамилэндопептидазы. Полученные данные свидетельствуют о том, что, в отличие от биосинтеза "раннего" фермента в фазе замедления роста, синтез глутамилэндопептидазы рекомбинантным штаммом В. зиЬгШз Л173 рУ в период, соответствующий поздним стадиям спорообразования, не подвержен катаболитной репре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.