научная статья по теме РЕГУЛЯЦИЯ ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У БАКТЕРИЙ Биология

Текст научной статьи на тему «РЕГУЛЯЦИЯ ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У БАКТЕРИЙ»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 3, с. 395-415

= ОБЗОРЫ

УДК 577.214.44

РЕГУЛЯЦИЯ ЭЛОНГАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У БАКТЕРИЙ

© 2011 г. С. А. Прошкин, А. С. Миронов*

Государственный научный центр "ГосНИИгенетика", Москва 117545 Поступила в редакцию 19.08.2010 г. Принята к печати 23.09.2010 г.

Элонгационный комплекс, включающий РНК-полимеразу, ДНК-матрицу и синтезируемую РНК, — центральный интермедиат в цикле транскрипции. Именно он служит главной мишенью для различных регуляторных факторов. В течение последних нескольких лет получено много структурных и биохимических данных, которые проливают свет на детали функционирования РНК-полимеразы. Недавно обнаружили функциональное взаимодействие между элонгационным комплексом РНК-полимеразы и транслирующей рибосомой. В представленном обзоре обсуждаются механизмы регуляции элонгации транскрипции у бактерий.

Ключевые слова: РНК-полимераза, элонгация транскрипции, прокариоты.

REGULATION OF BACTERIAL TRANSCRIPTION ELONGATION, by & A. Proshkin, A. S. Mironov (State Research Center "GosNII genetika", Moscow 117545; *e-mail: alexmir_98@yahoo.com). The elongation complex, which involves RNA polymerase, DNA template and nascent RNA, is a central intermediate in transcription cycle. It is elongation complex that represents the main target for the action of different regulatory factors. Over the past several years, many strUctural and biochemical data have been obtained that shed light upon the molecular details of RNA polymerase function. Cooperation between RNA polymerase elongation complex and translating ribosome was established recently. Here we discuss the mechanisms of the regulation of bacterial transcription elongation.

Keywords: RNA polymerase, transcription elongation, prokaryotes.

Транскрипция, осуществляемая РНК-полиме-разой, — ключевой этап экспрессии генов и клеточной регуляции. Используя нуклеозидтрифосфаты (МТР) в качестве субстрата, РНК-полимераза синтезирует РНК по матрице ДНК [1, 2]. Минимальный фермент (кор) РНК-полимеразы, осуществляющий элонгацию транскрипции, у бактерий состоит из четырех субъединиц (в', в, 2а и ю) массой около 0.4 МДа. Элонгационный комплекс служит конечной мишенью для различных регуляторных белковых факторов и сигналов, закодированных в ДНК и/или РНК [3]. Кроме того, взаимодействие РНК-полимеразы с компонентами других клеточных процессов (трансляции или репарации, например) позволяет координировать транскрипцию с отдельными этапами экспрессии генов.

СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ЭЛОНГАЦИОННОГО КОМПЛЕКСА РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

Функциональные участки РНК-полимеразы

В ходе обширных биохимических и генетических исследований локализован активный центр РНК-полимеразы [4—6], а также участки связыва-

ния нуклеиновых кислот, необходимых для стабильности элонгационного комплекса [7—11]. Выяснилось, что три остатка аспарагиновой кислоты в консервативном у всех многосубъединичных РНК-полимераз мотиве МАДКООВ самой большой субъединицы (в') хелатируют каталитический ион М§2+. Субъединицы в' и в формируют три сайта связывания: 1) сайт связывания дуплекса ДНК из ~10 п.н. перед активным центром, 2) сайт связывания гибридного участка РНК-ДНК длиной 8— 9 п.н., образующегося в "транскрипционном пузырьке" из 12—15 п.н. расплавленной ДНК, и 3) сайт связывания одноцепочечного участка РНК, удаленного на ~8—14 н. от З'-конца РНК [12] (рис. 1). Установление пространственной структуры кора РНК-полимеразы [13] позволило предложить модель элонгационного комплекса, в котором нуклеиновые кислоты расположены в соответствии с данными, полученными с помощью фотоаффинных сшивок белка с ДНК и РНК [14]. В это же время определили пространственную структуру эукариотической РНК-полимеразы II и обнаружили ее поразительное структурное сходство с бактериальным ферментом как в общем плане строения, так и в относительном расположении функциональных элементов [15, 16].

Принятые сокращения: TL — триггерная петля; TH — триггерная спираль; BH — а-спиральный мостик.

* Эл. почта: alexmir_98@yahoo.com

Транскрипционный пузырек 12—15 п.н.

Гибридный участок Дуплекс ДНК РНК-ДНК 8-9 п.н. ~10 п.н.

Рис. 1. Модель элонгационного комплекса РНК-по-лимеразы. Схематично показано расположение нуклеиновых кислот в составе комплекса, черный кружок символизирует активный центр фермента с каталитическим ионом магния.

Позже удалось определить пространственные структуры реконструированных элонгационных комплексов [17—21]. В них нуклеиновые кислоты представлены короткими цепочками ДНК и РНК, полученными химическим синтезом. В этих комплексах РНК частично комплементарна матрице ДНК в пределах неспаренной нуклеотидной последовательности (искусственного "транскрипционного пузырька"). Информация о молекулярных деталях пространственной организации элонгацион-ного комплекса позволила выделить вероятные структурные элементы РНК-полимеразы, ответственные за стабильность, процессивность и отклик на регуляторные сигналы. Важную особенность РНК-полимеразы представляют подвижные домены, необходимые для катализа и перемещения фермента по матрице ДНК. При построении структурной модели РНК-полимеразы ее домены, а также функционально значимые полипептидные петли получили специальные наименования, основанные на их расположении или предполагаемой функции (рис. 2).

Выяснилось, что в элонгационном комплексе передний (по ходу движения РНК-полимеразы) дуплекс ДНК располагается в основном канале между субъединицами Р' и р. Прямые контакты РНК-полимеразы с участком ДНК из ~10 п.н. образуют функциональный сайт связывания ДНК. Подвижный домен Р', названный "зажимом" (clamp), удерживает ДНК в канале [14, 17, 19].

Непосредственно перед активным центром, расположенном в конце основного канала, происходит, вероятно, плавление ДНК (позиция +2, считая от нуклеотидсвязывающего участка в положении +1) [17, 22]. Полипептидная петля субъединицы Р, "петля вилки-2" (fork loop-2, аминокислотные остатки 413—451 в РНК-полимеразе Thermus thermo-philus) стерически блокирует дальнейшее поступле-

ние спирали ДНК в активный центр, играя, по-видимому, главную роль в расплетании дуплекса ДНК и поддержании переднего края транскрипционного пузырька. В этом месте ДНК изгибается под углом ~90°, а далее формируется гибридный участок РНК-ДНК длиной 8-9 п.н. [8, 17, 19, 20]. Гибрид РНК-ДНК полностью укрыт в канале, стенки которого образованы субъединицами Р' и р. Доступ к активному центру через основной канал блокирован нуклеиновыми кислотами. Однако под активным центром располагается вторичный канал (secondary channel), который очевидно служит для поступления нуклеотидов к каталитическому участку и связыванию 3'-концевого одноцепочечного участка РНК при возвратном смещении фермента (см. ниже). Вторичный канал имеет вид воронки, постепенно сужаясь в направлении активного центра (рис. 2).

После синтеза 9 н. цепь РНК отделяется от ДНК. Петля Р'-субъединицы, названная "крышкой" (lid, аминокислотные остатки 525-539), стерически препятствует образованию более протяженного гибрида РНК-ДНК, облегчая вытеснение РНК [20, 23-26]. Восстановление дуплекса ДНК на заднем крае транскрипционного пузырька также вносит вклад в отделение РНК [23, 26]. В стабилизацию гибридного участка вовлечены, вероятно, еще петля "руль" (rudder, аминокислотные остатки 582-602) Р'-субъединицы [27] и "петля вилки-1" (fork loop-1, аминокислотные остатки 387-395) Р-субъединицы. Три полипептидные петли "крышка", "руль" и "петля вилки-1" образуют сеть межмолекулярных взаимодействий как между собой, так и с нуклеиновыми кислотами, формируя задний край транскрипционного пузырька [17]. Структурные элементы РНК-полимеразы у обоих концов гибридного участка РНК-ДНК обеспечивают поддержание постоянной его длины в ходе элонгации транскрипции.

Петля Р' "крышка" (lid) и участок Р "седловина" (saddle) формируют узкую пору, через которую проходит одноцепочечная РНК после отделения от гибрида РНК-ДНК [17, 19, 20]. Далее растущая цепь РНК попадает в более широкий канал между доменами Р' "застежка" (zipper, аминокислотные остатки 26-47) и "цинковый палец" (аминокислотные остатки 51-83), с одной стороны, и доменом Р "заслонка" (flap, аминокислотные остатки 703-830), с другой (рис. 2). Эти элементы РНК-полимеразы, по-видимому, вовлечены в узнавание сигналов тер-минации и антитерминации, а также пауз, зависящих от шпильки в РНК [28-30].

Предполагается, что все три участка связывания нуклеиновых кислот аллостерически взаимодействуют с активным центром фермента, модулируя каталитические свойства РНК-полимеразы. Очевидно, что эти функциональные участки наряду с вторичным каналом могут служить мишенями для регуляторных факторов элонгации/терминации.

"Заслонка

« ОЙР&

илки-1"

I \"Крышка" 5'-конец РНК

"Петля вилки З'-конец РНК--

'Петля вилки-2"

HjL

Спираль-спиральный участок у вторичного канала

Zn-палец"

Спираль-спиральный "" участок домена

"зажим"

Домен "зажим"

5'-конец РНК

Дуплекс РНК-ДНК^'

\ ^ I (BH)

^. Дуплекс' ДНК

"триггерная петля" \ ( (TL) Ч ,

\ I \

Вторичный канал

Рис. 2. Структура элонгационного комплекса РНК-полимеразы Thermus thermophilus. Выделены функциональные мобильные элементы белковой структуры, которые могут играть ключевую роль в цикле присоединения нуклеотидов, поддержании транскрипционного пузырька и во взаимодействии с РНК и дуплексом РНК-ДНК. Расположенные в активном центре фермента ионы магния показаны сферами. Также отмечены спираль-спиральные домены, взаимодействующие с элонгационными факторами (см. текст далее). Справа представлено сечение атомной модели элонгационного комплекса вдоль оси основного канала. Отмечено положение основного и вторичного каналов, а также дуплексов ДНК и РНК-ДНК. Рисунки подготовлены с помощью программ Accelris DS-Visualizer и RasMol c использованием координат атомов элонгационного комплекса (номер депонирования 2O5J) из Банка белковых структур (Protein Data Bank) (см. также [17, 18]).

Каталитические активности

В ходе матричного синтеза РНК-полимераза катализирует нуклеофильную атаку 3'-гидроксила растущей цепи РНК на а-фосфат поступающего МТР, в

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком