ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2014, том 50, № 2, с. 226-231
УДК 577
РЕГУЛЯЦИЯ ФИБРОНЕКТИНОМ ПЛАЗМЫ КРОВИ СВЯЗЫВАНИЯ ФАКТОРА РОСТА BMP-2 С КОЛЛАГЕНОМ
© 2014 г. Е. О. Осидак*, М. С. Осидак***, Д. Е. Сивогривов***, Т. С. Портная**, Т. М. Грунина*, Л. А. Соболева*, В. Г. Лунин*, А. С. Карягина*, С. П. Домогатский**
*Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России, 123098, Москва **Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава России, 121552, Москва ***ООО фирмы "Имтек", Москва, 121552 e-mail: egorosidak@gmail.com Поступила в редакцию 8.07.2013 г.
В работе исследована кинетика высвобождения rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля в присутствии плазмы крови. В ходе исследования впервые было обнаружено, что коллагенсвязывающие белки вытесняют rhBMP-2 из комплекса коллаген-ВМР-2. Экспериментально доказано, что именно фибро-нектин плазмы крови является основным коллагенсвязывающим белком ответственным за вытеснение rhBMP-2. В результате был создан новый коллагеновый гидрогель с включением фибронектина, способный в два раза увеличить время высвобождения rhBMP-2, по сравнению с коллагеновым гидрогелем. Отличительной особенностью разработанного коллаген-фибронектинового матрикса является факт отсутсвия быстрого высвобождения фактора роста в первые три дня, что позволит избежать побочных явлений, возникающих в клинической практике при быстром высвобождении больших количеств rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля.
DOI: 10.7868/S0555109914020147
Группа костных морфогенетических белков (bone morphogenic proteins, BMP) регулирует регенерацию костной ткани [1—3]. ВМР-2 индуцирует дифференцировку мезенхимальных клеток в хондрогенные и остеогенные клетки, а также способствует пролиферации остеобластов [4—6]. Ре-комбинантный BMP-2 человека (rhBMP-2) используется в клинике при лечении костных повреждений. Для улучшения фармакодинамических свойств препаратов rhBMP-2 существует потребность в разработке контролируемых систем доставки и замедленного высвобождения этого белка.
В тканевой инженерии используются биокомпозитные материалы, содержащие полимерный носитель, прогениторные клетки, а также факторы роста [7, 8]. Такие материалы вводятся непосредственно в зону повреждения, где они служат как источником факторов роста, так и субстратом для прикрепления клеток. Использование коллагена в качестве основного материала для контролируемых систем доставки ВМР-2 является предпочтительным из-за его слабой антигенности, биорезорбируемости в организме и биосовместимости [9]. Были разработаны системы доставки BMP-2, композитные остеопластические материалы отечественного производства, основанные на коллагене [10, 11]. Начато их применение в клиниках Российской Федерации [12]. Коллагеновые им-
плантаты способствуют пролиферации фибробла-стов и васкуляризации близлежащих тканей [13].
Известно, что ВМР-2 способен связываться с коллагеном [14, 15]. Включение рекомбинантно-го человеческого ВМР-2 (rhBMP-2) в состав коллагенового гидрогеля обеспечивает его замедленное высвобождение в окружающие ткани по сравнению с введением rhBMP-2 в виде раствора без носителя [16, 17]. В ряде публикаций приводятся данные по кинетике высвобождения rhBMP-2 из коллагеновых биоматериалов in vitro при инкубации в водно-солевых растворах [18—20]. Однако в организме имплантированный коллагеновый носитель с rhBMP-2 омывается либо экссудатом крови, либо тканевой жидкостью.
Цель работы — оценить влияние компонентов плазмы крови на процесс высвобождения rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля.
МЕТОДИКА
В работе были использованы следующие материалы: водный коллоидный раствор нативного коллагена I и III типа (10 мг/мл) из сухожилий крыс, содержащий 20 мМ уксусную кислоту, pH 3.5 (C13p Q, "Имтек", Россия); водный коллоидный раствор нативного коллагена I типа (1.0 мг/мл) из плаценты человека, содержащий
20 мМ уксусную кислоту, pH 3.5 (H C11, "Имтек", Россия); водно-солевой раствор фибронектина из плазмы крови человека (1.8 мг/мл), содержащий 20 мМ трис, 150 мМ NaCl, pH 7.3 (Fne H, "Имтек", Россия); водно-солевой раствор, содержащий 3.4 мг/мл rhBMP-2, 10 мМ NaCl, 20 мМ уксусную кислоту, pH 4.5. Методика получения препарата rhBMP-2 и его основные характеристики описаны в статье Шараповой и др. [21]. Свежая плазма крови человека, антикоагулированная ЭДТА была получена от здоровых доноров, не содержащая антител к вирусам ВГС, ВИЧ, и антигенов вируса гепатита B; прочие реактивы — натрия фосфат, калия фосфат, натрия хлорид, калия хлорид, кальция хлорид, магния сульфат, мочевина, ЭДТА фирмы "Sigma", США.
Приготовление плазмы крови человека без кол-лагенсвязывающих белков. Свежая плазма крови человека, антикоагулированная ЭДТА, при температуре 37°C была пропущена в течение 4 ч через равный объем сорбента с иммобилизованным коллагеном (S-Col, "Имтек", Россия). Белки, связавшиеся с коллагеном, после тщательной отмывки сорбента фосфатным буферным раствором Рингера-Кребса (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2.5 мМ CaCl2, 1.2 мМ KH2PO4, 1.2 мМ MgSO4, 16 мМ Na2HPO4, pH 7.4) были элюированы раствором, содержащим 6 М мочевину и 10 мМ ЭДТА, pH 6.5. Белковый состав элюата анализировали методом электрофореза в полиакрила-мидном геле (6% и 10%) в присутствии додецил-сульфата натрия по Лемли (Na-ДДС-ПААГ).
Приготовление плазмы крови человека без фибронектина. Свежая плазма крови человека, анти-коагулированная ЭДТА, при температуре 37°C была пропущена в течение 4 ч через сорбент с иммобилизованными моноклональными антителами к фибронектину человека (S-IM FneH, "Имтек", Россия) в соотношении объемов 3 : 1.
Определение концентрации фибронектина.
Концентрация фибронектина в плазме, пропущенной через сорбент с коллагеном, и в плазме, пропущенной через сорбент с моноклональными антителами, контролировалась с помощью тест-системы "ИФА-Фибронектин" ("Имтек", Россия). Моноклональные антитела к фибронектину человека были адсорбированы на поверхности 96-ти луночного планшета ("Sarstedt", Германия). В ячейках инкубировали исследуемые образцы и стандарты, разведенные серийно с шагом 1 : 3. После инкубации вносили во все лунки планшета препарат поликлональных кроличьих антител, конъюгированных с пероксидазой. Ферментативную активность пероксидазы, проявляли раствором хромогенного субстрата, на основе 3, 3', 5, 5'-тетраметилбензидина гидрохлорида (ТМБ) с пе-роксидом водорода. Оптическую плотность при дли-
не волны 450 нм в ячейках планшета детектировали на фотометре УНИПЛАН ("Пикон", Россия).
Взаимодействие BMP-2 с коллагеном I типа.
Коллаген человека I типа иммобилизовали на активированной Сефарозе 4В ("Pharmacia Biotech", Швеция) в соответствии с рекомендациями производителя. В результате 1.8 мг коллагена было связано с 1.0 мл геля коллаген-сефарозы. Колонка, содержащая 0.2 мл сорбента, была промыта фосфатным буферным раствором Рингера-Кребса (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2.5 мМ CaCl2, 1.2 мМ KH2PO4, 1.2 мМ MgSO4, 16 мМ Na2HPO4, pH 7.4). Через колонку при 37°C был пропущен тот же раствор, содержащий rhBMP-2 в концентрации 0.1 мг/мл, до полного насыщения сорбента. Промывку колонки провели десятью объемами раствора Рингера-Кребса. Для определения количества связанного rhBMP-2 элюцию с сорбента проводили раствором, содержащим 6 М мочевину и 10 мМ ЭДТА, pH 6.5.
Для оценки влияния белков плазмы крови на связывание BMP-2 c коллагеном в качестве омывающего раствора была выбрана плазма крови человека.
Для проверки гипотезы о способности фибро-нектина плазмы крови регулировать взаимодействие BMP-2 с коллагеном в качестве омывающих растворов были выбраны: человеческая плазма крови без фибронектина, человеческая плазма крови без фибронектина с восстановленной концентрацией фибронектина до 0.3 мг/мл и раствор чистого фибронектина (0.3 мг/мл).
Для каждого случая собирали фракции по 0.2 мл при скорости протекания растворов 3 мл/ч.
Взаимодействие rhBMP-2 c фибронектином. Фибронектин иммобилизовали на активированной Сефарозе 4В ("Pharmacia Biotech", Швеция) в соответствии с рекомендациями производителя. В результате 5 мг фибронектина было связано с 1.0 мл геля сефарозы. Колонка, содержащая 0.2 мл сорбента, была промыта фосфатным буферным раствором Рингера-Кребса (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2.5 мМ CaCl2, 1.2 мМ KH2PO4, 1.2 мМ MgSO4, 16 мМ Na2HPO4, pH 7.4). Через колонку при 37°C был пропущен тот же раствор, содержащий rhBMP-2 в концентрации 0.1 мг/мл, до полного насыщения сорбента. Промывку колонки проводили десятью объемами раствора Рингера-Кребса. Для определения количества связанного rhBMP-2 элюцию проводили раствором, содержащим 6 М мочевину и10 мМ ЭДТА, pH 6.5.
Приготовление коллагенового матрикса с включением rhBMP-2. Коллоидный раствор крысиного коллагена (8 мл, 10 мг/мл) смешали с 0.3 мл раствора rhBMP-2 в концентрации 3.4 мг/мл, содержащим 10 мМ NaCl и 20 мМ уксусной кислоты, pH 3.5. Полученную смесь, титруя при постоянном перемешивании, доводили раствором 1 M
№ОН до нейтрального рН. Смесь инкубировали при 4°С в течение 2 ч, затем разливали по 1.0 мл в лунки 24-луночного планшета. Для формирования геля полученную смесь инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Образованные коллагено-вые гидрогели, извлеченные из планшета, отмывали в 500 мл фосфатного буферного раствора Рингера-Кребса при комнатной температуре в течение 24 ч с заменой раствора каждые 8 ч.
Приготовление коллагенового матрикса с включением фибронектина и гИБМР-2. Все процедуры выполняли аналогично вышеприведенной методике приготовления коллагенового матрикса, но в исходную смесь дополнительно было введено 0.3 мг высокоочищенного фибронектина.
Вымывание rhBMP-2 из коллагенового гидрогеля. Вымывание гИБМР-2 из сформированных ге-левых дисков объемом 1.0 мл оценивали, инкубируя их в фиксированном объеме (5.0 мл) цельной плазмы крови человека при постоянном перемешивании. В каждую экспериментальную группу входило по 5 образцов. Перед сменой омывающего раствора часть его отбирали для определения количества вышедшего из геля гИБМР-2.
Определение количества rhBMP-2 в исследуемых образцах. Ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.