БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2012, том 29, № 3, с. 200-208
УДК 577.352.4
РЕГУЛЯЦИЯ КАНАЛОВ ТЯРС6 НЕСТЕРОИДНЫМИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ
© 2012 г. Д. В. Илатовская1, 2#, Т. С. Павлов1**, Ю. А. Негуляев2, А. В. Старущенко1
Медицинский Колледж Висконсина, 8701 Вотертаун Планк Роуд, Милуоки, Висконсин, 53226 США;
*электронная почта: tpavlov@mcw.edu 2Институт цитологии РАН, Тихорецкий проспект, 4, 194064, Санкт-Петербург, Россия
Поступила в редакцию 26.07.2011 г.
После доработки 13.09.2011 г.
Наследственный фокально-сегментарный гломерулосклероз, характеризующийся заменой отдельных петель клубочка почки плотной соединительной тканью и их гиалинозом, является одной из причин нефротического синдрома. Мутации гена, кодирующего ионный канал ТИРС6, могут приводить к возникновению этого заболевания. Недавно мы показали, что в подоцитах свежевыделен-ных гломерул крысы нестероидные противовоспалительные препараты диклофенак и ибупрофен снижают активность нативных каналов, которые по своим биофизическим характеристикам похожи на каналы семейства ТИРС. Также установлено, что каналы ТИРС6 экспрессируются в подоцитах. Для проверки предположения об ингибировании работы каналов ТИРС6 нестероидными противовоспалительными препаратами мы реконструировали их путем временной трансфекции в клетках линий НЕК-293 и СНО. Нами изучен эффект диклофенака на активность канала ТИРС6 дикого типа и его мутантой формы ТИРС6РШЯ встречающейся при наследуемой форме фокально-сегментарного гломерулосклероза. Измерения внутриклеточной концентрации кальция в клетках, трансфицированных мутантным каналом, выявили существенно более интенсивное нарастание концентрации кальция в ответ на стимуляцию агонистом М-холинорецепторов карбахолом по сравнению с трансфицированными каналами дикого типа. Кроме того, проведена регистрация ионных токов методом локальной фиксации потенциала. Аппликация диклофенака (500 мкМ) вызывала подавление активности одиночных каналов ТИРС6 в течение нескольких минут. Преинку-бация с диклофенаком (100 мкМ) также снижала интегральный ток через мембрану клеток СНО, экспрессирующих ТИРС6Р112^. Таким образом, наряду с данными о влиянии нестероидных препаратов на ТИРС-подобные каналы в свежевыделенных гломерулах крысы, результаты нашего исследования позволяют предположить, что каналы ТИРС6 в подоцитах могут служить мишенями для нестероидных противовоспалительных препаратов и быть объектом терапевтического действия при фокально-сегментарном гломерулосклерозе.
Ключевые слова: ТИРС6, нестероидные противовоспалительные препараты, кальций, ионные каналы, фокально-сегментарный гломерулосклероз.
Образование мочи начинается с клубочковой фильтрации, т.е. с переноса фильтруемых веществ от гломерулярных капилляров в боуменову капсулу. Фильтрационный барьер гломерулы состоит из фе-нестрированого эндотелия капилляров, базальной мембраны, которая покрывает внешнюю поверхность капилляров, и подоцитов. Ножки подоцитов с переплетающимися пальцевидными отростками тесно контактируют с базальной мембраной и формируют щели и щелевидные диафрагмы, необходимые для фильтрации. Нарушения структуры подо-цитов и взаимодействия их ножек с базальной мембраной приводят к потере функциональности фильтрующего аппарата [1] и, следовательно, к соответствующим заболеваниям почек.
# Данные авторы приняли равное участие в работе.
Белок TRPC6 является членом семейства каналов TRPC (transient receptor potential canonical channels), экспрессирующихся в различных органах, включая сердце, мозг и почку, где данные каналы участвуют в транспорте катионов в специализированные клетки. Критическая значимость TRPC6, локализованных в подоцитах, в регуляции функций гломерулы и, соответственно, в фильтрации первичной мочи, показана в нескольких лабораториях. Обнаружено, что некоторые мутации гена, кодирующего этот канал, приводят к развитию наследуемого фокально-сегментарного гломерулосклероза [2—4]. На рис. 1 представлена морфология гломерул крысы в норме (рис. 1а) и с характерными для этого заболевания признаками, развившимися в результате гипертонии, индуцированной высокосолевой диетой (рис. 1б). Гистологически выявляются участки
Рис. 1. Морфология гломерулы при фокально-сегментарном гломерулосклерозе. Примеры окрашенных эозином-гематоксилином гистологических срезов почек крыс-самцов линии Dahl SS, содержавшихся на нормальной (а) и высокосолевой (б) диете. а — В нормальной гломеруле весь клубочек (К) имеет правильную структуру, просвет (П) боуме-новой капсулы хорошо выражен. б — На высокосолевой диете у крыс повышается артериальное давление, что приводит к нарушению структуры некоторых отделов нефрона. Представленная гломерула увеличена по сравнению с нормой, в ней наблюдается сегментарная склеротизация (С) клубочка и срастание склеротизированного участка со стенкой боуменовой капсулы. Размер масштабного отрезка — 50 мкм.
склеротизации внутри пораженной гломерулы и срастание клубочка со стенкой боуменовой капсулы. У использованных для получения рис. 1 крыс линии Dahl SS (Salt-Sensitive) при переводе на высокосолевую диету в течение нескольких дней развивается гипертония и сопутствующие заболевания почек. Эта линия крыс успешно применяется для изучения различных сердечно-сосудистых и почечных заболеваний [5—8].
Нестероидные противовоспалительные препараты (НСПВП) широко распространены в медицине и научных исследованиях в качестве ингибиторов циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты. В клинической практике они используются при состояниях, связанных с острым и хроническим воспалением, болями, снижением свертываемости крови. Кроме того, показана роль НСПВП при дополнительной терапии фокально-сегментарного гломе-рулосклероза [9, 10]. Однако, точный механизм их действия остается невыясненным. Более того, НСПВП довольно редко применяются при заболеваниях почки, так как вызывают различные побочные эффекты.
Ранее было показано, что НСПВП способны влиять на активность различных классов ионных каналов [11—13]. Кроме того, описан их эффект на активность ионных каналов почки, включая регуляцию эпителиального натриевого (ENaC), калиевых и хлорных каналов [14—16]. Недавно, разработав новый подход к регистрации ионных
токов в подоцитах изолированных нативных гло-мерул крысы, мы описали снижение активности каналов TRPC под воздействием НСПВП. С помощью метода локальной фиксации потенциала нами показано, что два структурно независимых НСПВП — диклофенак и ибупрофен — оказывают значительный ингибирующий эффект на натив-ные каналы TRPC в подоцитах изолированных гломерул [17]. Однако, в связи с отсутствием специфических блокаторов каналов TRPC определенного типа, проведенные нами исследования ex vivo не позволяют с точностью определить специфичность каналов. Так как нами и др. исследователями [17—19] было показано, что TRP каналы нескольких типов, включая TRPC3 и TRPC6, экспрессируются в подоцитах, перед нами стояла задача изучить кратко- и долговременные эффекты НСПВП в отношении каналов TRPC6. Кроме того, был использован мутантный вариант TRPC6P112Q. Замена пролина-112 на глутамин в структуре канала описана у больных наследуемым фокально-сегментарным гломерулосклеро-зом. Эта замена приводит к повышению активности канала в плазматической мембране и увеличению ангиотензин-зависимого кальциевого тока. Показано также, что в клетках HEK-293 базовая и стимулированная карбахолом и ангиотензином II активность экспрессированного мутантного канала в экспериментах whole-cell была существенно выше, чем канала дикого типа [4]. Измерение внутриклеточной концентрации кальция в транс -фицированных клетках выявило существенно более
интенсивное нарастание концентрации кальция в ответ на стимуляцию карбахолом клеток, трансфи-цированных мутантным белком TRPC6P112Q, по сравнению с клетками, трансфицированными каналами дикого типа. Регистрация ионных токов показала, что аппликация диклофенака (500 мкМ) вызывала подавление активности одиночных каналов TRPC6 в течение нескольких минут. Преинкубация с диклофенаком также снижала интегральный ток через мембрану клеток CHO, экспрессирующих TRPC6P112Q. Таким образом, НСПВП снижают ток как через каналы TRPC6 дикого типа, так и через мутантный канал, характерный для наследственной формы фокально-сегментарного гломе-рулосклероза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Гистологическое исследование гломерул. Для
демонстрации морфологии гломерул, характерной для сегментарного гломерулосклероза, использовали самцов крыс линии Dahl SS. Крысы этой линии генетически предрасположены к формированию высокого артериального давления при высоком содержании натрия в корме [20, 21]. Крысы, содержавшиеся в виварии Медицинского Колледжа Висконсина, в возрасте 8 нед вместо корма с нормальным содержанием соли (0.4%) в течение 2 нед получали корм с высоким (4%) содержанием соли. Как показано ранее, этого периода было достаточно для формирования гипертонии и сопутствующих нарушений в тканях почек крыс [20, 21]. Крыс эвтаназировали в соответствии с ветеринарным протоколом, утвержденным Медицинским Колледжом Висконсина. Почки фиксировали в 10% формалине, пара-финизировали и использовали для приготовления гистологических срезов толщиной 3 мкм. После удаления парафина срезы окрашивали эозином-гематоксилином; морфологию гломерул определяли с помощью микроскопа Nikon, оборудованного фотокамерой [22].
Клеточные культуры и трансфекция. Эмбриональные клетки почек человека HEK293 получили из коллекции клеточных культур Института Цитологии РАН и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 80 мкг/мл ген-тамицина. Клетки яичника китайского хомяка (CHO) дикого типа получили из Американской Коллекции Клеточных Культур (ATCC). Клетки CHO, стабильно экпрессирующие М1-холиноре-цептор, предоставлены проф. Марком Шапиро (Центр медицинских наук Университета Техаса в Сан-Антонио, США) [23]. Обе линии растили в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина. Клетки культивировали при 37°С и 5% СО2 и пересевали каждые 48 ч
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.